Что за анализ пцр

Что такое анализ ПЦР? - статья лаборатории ДНКОМ

Просмотров: 5904 Опубликовано: 10.02.2022 / Обновлено: 08.05.2022

• COVID-19
• Инфекции
• ПЦР

Суть метода ПЦР

ПЦР (полимеразная цепная реакция) — это молекулярно-биологический метод, в основе которого лежит амплификация (то есть многократное увеличение) фрагментов ДНК в биоматериале.

Метод ПЦР применяется во многих сферах деятельности, в том числе в качестве быстрого и высокоточного способа диагностики определенных инфекционных и генетических заболеваний человека, а также для выявления спонтанных или унаследованных изменений в ДНК, исследованиях генома сельскохозяйственных растений и животных для селекционных и других задач, в криминалистике, археологии, установлении отцовства, клонировании и секвенировании геномов и прочих сферах деятельности человека.

Вирусы, бактерии и грибы - основные человеческие патогены - содержат ДНК или РНК, причем для каждого вида последовательность нуклеотидов уникальна. Короткие фрагменты, комплементарные целевым участкам нуклеотидов каждого возбудителя, называются праймерами.

В основе анализа на ПЦР лежит создание большего числа копий генетического материала (ДНК или РНК) с помощью этих самых праймеров и специальных ферментов посредством серии циклов нагрева и охлаждения. Полученные амплифицированные сегменты далее методом гель-электрофореза (или с помощью другой технологии) сравниваются с другими нуклеотидными сегментами из известного источника (например, патогенного микроорганизма) для определения их идентичности.

ПЦР в реальном времени — это разновидность ПЦР, которая позволяет отслеживать процесс амплификации в режиме реального времени и может использоваться для количественной оценки присутствующей ДНК / РНК. Это один из основных методов обнаружения бактерий или вирусов на молекулярном уровне, с более высокой степенью точности, чем микроскопические или бактериологические исследования, и значительно более быстрый, чем метод культивирования.

Это также единственный способ определить наличие генетических вариаций, указывающих на предрасположенность к онкологическим и другим заболеваниям. Чувствительность диагностических инструментов для выявления мутаций онкогенов и генов подавления опухоли была улучшена по крайней мере в десять тысяч раз благодаря ПЦР, что позволяет раньше диагностировать, например, такие виды рака, как лейкемия. Метод ПЦР также позволил разработать индивидуальную терапию для больных раком.

Кроме того, ПЦР может использоваться для типирования тканей, которое имеет жизненно важное значение для имплантации органов.

ПЦР также имеет клиническое применение в области пренатального тестирования различных генетических заболеваний и / или клинических патологий. Образцы берут либо с помощью амниоцентеза либо с помощью биопсии ворсин хориона.
В отличие от многих других тестов, ПЦР тест способен обнаружить признаки заболевания на самых ранних стадиях инфицирования, так как для выделения искомого ДНК или РНК достаточно минимального количества генетического материала патогена в образце биоматериала. Другие виды исследования могут оказаться ложноотрицательными из-за того, что в образце недостаточно много вирусов или бактерий или организм не успел выработать достаточное количество антител.

ПЦР-анализ проводится на образце одного из следующих видов биоматериала: кровь, слюна, слизь, ткань, гной, мокрота, моча. Некоторые вирусы, включая новый коронавирус, состоят из РНК, а не ДНК. Их РНК перед амплификацией должна быть преобразована в ДНК. Этот процесс называется ПЦР с обратной транскрипцией.

На сегодняшний день ПЦР тест является стандартом для выявления наличия коронавируса SARS-CoV-2, вызывающего Covid-19. Тесты ПЦР определяют, инфицирован ли пациент в настоящее время вирусом SARS-CoV-2 и, следовательно, заразен ли он. ПЦР может обнаружить РНК COVID-19 только в том случае, если человек был недавно инфицирован или уже длительное время болеет. Обнаружение вирусной РНК с помощью ПЦР позволяет обеспечить диагностику COVID-19 на ранней стадии - до того, как организм выработает ответ в виде антител или даже до того, как у человека появятся симптомы заболевания.

Преимущества метода ПЦР

ПЦР тесты применяются в медицинской диагностике уже более 40 лет и считаются наиболее эффективным методом выявления многих инфекционных заболеваний, включая COVID-19, ВИЧ, Эбола, многих урогенитальных инфекций, герпесвирусов и других. Это “золотой стандарт” в медицинской инфекционной диагностике. Тесты ПЦР играют решающую роль в предотвращении распространения заболеваний, так как часто позволяют выявить инфекции на ранней стадии, еще до появления симптомов.

Анализ ПЦР обладает высокой чувствительностью (для обнаружения инфекционного агента достаточно всего нескольких молекул ДНК патогена) и специфичностью (для большинства инфекций она достигает 100%). Количественный ПЦР-анализ позволяет оценить инфекционную нагрузку на организм, а также используется для анализа изменений экспрессии генов в опухолях.

Важна также и высокая скорость проведения исследования. В отличие от традиционного посева при выявлении бактериальных инфекций, который занимает несколько дней, ПЦР тест обычно выполняется в течение суток. Это значительно увеличивает вероятность назначения своевременного лечения. Кроме того, с помощью ПЦР можно определить латентных носителей инфекции.

Недостатки метода ПЦР

На чувствительность и специфичность ПЦР теста серьезно влияют правила и условия его проведения. Необходимо строго соблюдать правила сбора биоматериала и его хранения.

Важно выбрать правильное время взятия биоматериала и выполнить правила подготовки к тесту. В частности, это касается и нового коронавируса, который присутствует в выделениях носоглотки и ротоглотки только в течение определенного времени, по истечении которого анализ окажется отрицательным.

Кроме того, высокая чувствительность ПЦР может иногда превращаться из преимущества в недостаток. Следы примесей РНК или ДНК в образце могут привести к результатам, вводящим в заблуждение.

Показания к проведению ПЦР-анализа

ПЦР-тесты используются для:

• диагностики инфекционных заболеваний, вызванных вирусами, бактериями и грибами, в том числе для определения возбудителей ряда урогенитальных инфекций;
• определения патологических генетических нарушений;
• определения роста и развития раковых клеток.

ПЦР-анализ широко используется для определения возбудителей респираторных инфекций, в том числе для диагностики коронавирусной инфекции SARS-CoV-2.

ПЦР тест также можно использовать для прямой диагностики наличия заболевания и мутаций в развивающемся эмбрионе. Например, впервые ПЦР была использована таким образом для диагностики серповидно-клеточной анемии путем обнаружения мутации одного гена.

Подготовка к проведению ПЦР-теста

Исследование на ПЦР не требует сложной и специальной подготовки.

• при взятии крови достаточно не принимать пищу утром в день исследования;
• при взятии мазка из ротоглотки/носоглотки важно за 4 часа не принимать пищу и жидкости, не полоскать горло;
• исследование урогенитального отделяемого требует воздержания от половой активности в течение одного дня.

Как проводится ПЦР-анализ

Метод полимеразно-цепной реакции постоянно развивается.

1. Самым распространенным на сегодня является тест в реальном времени, с помощью которого можно определить исходное количество копий ДНК (РНК).
2. ПЦР с обратной транскрипцией используется для “перевода” РНК в ДНК.
3. ПЦР с вложенной парой праймеров (гнездовая) проводится в две стадии для снижения вероятности амплификации неспецифичных участков ДНК.
4. Инвертированная ПЦР используется в случае, когда нужно выяснить природу неизвестных участков ДНК, окружающих известный.

Это только часть методов ПЦР, количество которых постоянно пополняется новыми технологичными вариантами.

Для проведения анализа биоматериала с помощью ПЦР необходимо обеспечить его правильное взятие. При взятии мазка из носоглотки или ротоглотки образец биоматериала собирают путем введения длинного зонда-тампона в ноздрю или в заднюю часть горла.

Во время анализа крови медицинский работник возьмет образец из вены на руке с помощью небольшой иглы.

Результаты ПЦР-теста

Положительный результат ПЦР теста означает, что пациент в настоящее время инфицирован определенным патогеном. Количественный ПЦР (в реальном времени) позволяет также оценить инфекционную нагрузку, а также определить момент, когда условно-патогенные микроорганизмы стали патогенными в результате неконтролируемого роста.

Отрицательный результат ПЦР теста может означать, что пациент в настоящее время не инфицирован, либо что ДНК/РНК патогена отсутствует во взятом образце биоматериала, либо что образец был взят спустя слишком долгое время после заражения, чтобы вирус был обнаружен.

Список источников

1. Mousa G. Ghannam; Matthew Varacallo. Biochemistry, Polymerase Chain Reaction. StatPearls Publishing, 2021.
2. Sarah Maddocks, Rowena Jenkins. Understanding PCR. A Practical Bench-Top Guide, 1st edition, 2016.
3. https://medlineplus.gov/
4. https://www. mayoclinic.org/tests-procedures/covid-19-diagnostic-test/about/pac-20488900
5. https://www.emedicinehealth.com/pcr_polymerase_chain_reaction_test/article_em.htm
6. Ребриков Д., Саматов Г., Трофимов Д. ПЦР в реальном времени. — М.: Лаборатория знаний, 2021.
7. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. — М.: Мир, 2002.

ПЦР на COVID-19

ПЦР-тест на коронавирус: как берут, что показывает

ПЦР – сложная химико-биологическая цепная реакция, позволяющая методом поэтапного исследования определить в тканях организма человека чужеродные компоненты, вирусные и бактериальные структуры, грибки.

Вирус SARS-CoV-2 относится к респираторным агентам и в организм попадает через слизистые – нос, глаза, рот. В клетках слизистых тканей он фиксируется, прикрепляясь шипами оболочки к клеточным мембранам. А вот в крови и лимфе вируса нет. Анализ крови становится показательным только при длительной болезни, когда появляется иммунный ответ организма на вирусную атаку. В этом случае ПЦР уже не информативен, и при подозрении на COVID стоит сдавать иммуноферментный анализ (ИФА) крови – определять антитела к вирусной инфекции.

В первые дни заражения, когда симптоматика заболевания отсутствует или слабо выражена, SARS-CoV-2 уже активно размножается в носоглотке. Инфекцию легко обнаружить в тканях слизистых и даже в слюне. Носители вируса могут и не подозревать о его наличии, и определить, заразен ли человек, может только анализ ПЦР.

Мазок для выявления короновируса методом ПЦР берут из ротоглотки и носоглотки. Для этого используют зонд со стерильной щеточкой или тампоном. Медсестра безболезненно и аккуратно проводит несколько раз по слизистым пациента, а затем биоматериал запаковывают и передают в лабораторию для тщательного исследования.

Показания для диагностики: кому стоит сдавать ПЦР на ковид

Выделяют несколько категорий, кому показана диагностика на короновирус методом ПЦР:

1. Условно здоровые люди. Исследование для них – возможность получить справку об отсутствии ковид для выезда или иных целей.
2. Контактные – те, кто общался с заболевшими, не зная об этом. После лабораторного подтверждения заболевания у родных, знакомых или сотрудников, рекомендована диагностика на «корону» методом ПЦР.
3. Пенсионеры и лица, попадающие в группу риска по состоянию здоровья.
4. Корпоративная диагностика – при выявлении в коллективе заболевшего или в качестве планового обследования.

Анализ проводят при отсутствии симптомов заболевания новой короновирусной инфекцией – пациентам без высокой температуры, кашля, слабости, отдышки.

ПЦР на COVID-19: подготовка к анализу

Тест чувствительный, поэтому во избежание риска получения неправильного результата до проведения ПЦР следует соблюдать определенные правила:

1. За 2-3 часа до взятия мазков из ротоглотки пациент не должен принимать пищу, курить, полоскать горло или рот, чистить зубы, жевать жевательную резинку.
2. В течение суток до момента сдачи анализа использовать сосудосуживающие назальные спреи, наносить гормональные, антисептические или противовирусные мази, а также не применять спреи для местного лечения горла.

Результаты диагностики

Проведенный тест бывает:

• отрицательный – вирус SARS-CoV-2 не определен, инфекции COVID-19 нет;
• положительный – найден вирус SARS-CoV-2, инфекция COVID-19 подтверждена.

Медицинский центр «ЛМ-клиника» проводит ПЦР-исследования на короновирусную инфекцию для частных лиц и организаций. Квалифицированный подход и внимательность медперсонала гарантируют высокую точность каждого исследования. Для записи на анализ методом ПЦР достаточно позвонить по телефону клиники или оставить заявку на сайте.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Введение

ПЦР (полимеразная цепная реакция)

— это революционный метод, разработанный Кэри Маллис в 1980-х годах. ПЦР основана на использовании способности ДНК-полимеразы синтезировать новую цепь ДНК, комплементарную предложенной цепи матрицы. Поскольку ДНК-полимераза может добавлять нуклеотид только к уже существующей 3'-ОН-группе, ей нужен праймер, к которому она может добавить первый нуклеотид. Это требование позволяет очертить конкретную область матричной последовательности, которую исследователь хочет амплифицировать. В конце реакции ПЦР конкретная последовательность будет накапливаться в миллиардах копий (ампликонов).

Как это работает

Компоненты ПЦР Матрица ДНК – образец ДНК, содержащий целевую последовательность. В начале реакции к исходной двухцепочечной молекуле ДНК прикладывают высокую температуру, чтобы отделить нити друг от друга. ДНК-полимераза — тип фермента, синтезирующего новые нити ДНК, комплементарные целевой последовательности. Первым и наиболее часто используемым из этих ферментов является 9. ДНК-полимераза 0022 Taq (из Thermis aquaticus ), тогда как ДНК-полимераза Pfu (из Pyrococcus furiosus ) широко используется из-за ее более высокой точности при копировании ДНК. Хотя эти ферменты слегка различаются, они оба обладают двумя свойствами, которые делают их подходящими для ПЦР: 1) они могут генерировать новые нити ДНК с использованием ДНК-матрицы и праймеров и 2) они термоустойчивы. Праймеры – короткие фрагменты одноцепочечной ДНК, комплементарные целевой последовательности. Полимераза начинает синтезировать новую ДНК с конца праймера. Нуклеотиды (dNTP или дезоксинуклеотидтрифосфаты) — отдельные единицы оснований A, T, G и C, которые по существу являются «строительными блоками» для новых цепей ДНК. RT-PCR (ПЦР с обратной транскрипцией) представляет собой ПЦР, которой предшествует преобразование образца РНК в кДНК с помощью фермента обратной транскриптазы . Ограничения ПЦР и ОТ-ПЦР Реакция ПЦР начинает экспоненциально генерировать копии целевой последовательности. Только во время экспоненциальной фазы реакции ПЦР возможна обратная экстраполяция для определения начального количества целевой последовательности, содержащейся в образце. Из-за ингибиторов полимеразной реакции, обнаруженных в образце, ограниченности реагентов, накопления молекул пирофосфата и самоотжига накапливающегося продукта реакция ПЦР в конечном итоге перестает амплифицировать целевую последовательность с экспоненциальной скоростью, и возникает «эффект плато». что делает ненадежным количественное определение конечной точки продуктов ПЦР. Именно это свойство ПЦР делает количественную ОТ-ПЦР в реальном времени столь необходимой.

Примеры запросов

Ресурсы

» «Полимеразная цепная реакция» [MAJR]

Примечание. [MAJR] — это тег медицинского предметного заголовка (MeSH) для основного заголовка. Тег используется для ограничения поиска статей, основные темы которых представлены терминами, включенными в базу данных NLM MeSH.

Справка

• Обзор ProbeDB
• Объявления
• Загрузка
• Глоссарий

Применение

• Экспрессия генов
• Заглушение генов
• Анализ вариаций
• Картирование генома

Технологии

• Массивы шариков
• Микрочипы
• Морфолинос
• Зонды Overgo
• Ресеквенирование
• РНКи
• ПКР
• СТС
• qRT-PCR в реальном времени
• Зонды SSO
• РАПД
• ПДРФ
• АФЛП
• КАПС
• dCAPS
• МПСС
• МИП
• ИШ

Проекты

• Генсат
• HapMap
• Вариант SEQr
• Такман
• ТРЦ
• RNAi Global

Дистрибьюторы

• Открытые биосистемы
• Прикладные биосистемы

Введение в ПЦР-анализ | Bio-Rad

Просмотреть каталог

• Schnelle Bestellung
• Die Bio-Rad-Literaturbibliothek
• Kontaktieren Sie uns

В зависимости от требуемой информации существует множество различных методов анализа продуктов реакции ПЦР. Электрофорез в агарозном геле является распространенным методом для определения наличия или отсутствия целевой последовательности и длины фрагмента. Методы обнаружения мутаций, такие как денатурирующий градиентный гель-электрофорез (DGGE) и временной температурный гель-электрофорез (TTGE), используют акриламидный гель для облегчения идентификации мутаций в продукте ПЦР. Методы полуколичественного анализа позволяют использовать электрофорез в агарозном геле для приблизительного определения исходного количества материала. Секвенирование и метод секвенирования следующего поколения используются, когда необходимо определить последовательность ампликона.

Связанные темы: Приборы для ПЦР, реагенты для ПЦР, разработка и оптимизация ПЦР-анализа и поиск и устранение неисправностей ПЦР.

Page Contents

Продукты ПЦР чаще всего анализируют с помощью электрофореза в агарозном геле. Результаты можно визуализировать с помощью бромистого этидия или нетоксичных красителей, таких как SYBR ^® зеленый. Интенсивность полосы можно использовать для оценки количества продукта данной молекулярной массы по отношению к лестнице. Гель-электрофорез также показывает специфичность реакции, где наличие нескольких полос указывает на вторичные продукты амплификации.

Вернуться к началу

ПЦР и ПЦР с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) обычно используются для обнаружения видов ДНК и РНК соответственно. Однако количественное применение этих методов было ограничено. Теоретически ПЦР экспоненциально амплифицирует матричную ДНК с удвоением матрицы в каждом цикле, так что относительные различия между образцами можно измерить как интенсивность полос на геле.

Ограничение состоит в том, что на более поздних этапах ПЦР эффективность снижается, и амплификация выходит на плато. Это означает, что количество продукта в реакции больше не пропорционально количеству исходного материала и не может быть определено количественно. Относительные количества амплифицированной ДНК в различных реакциях ПЦР можно сравнивать только тогда, когда реакции все еще находятся в экспоненциальной фазе амплификации. По этим причинам qPCR является наиболее часто используемым методом количественного анализа.

Если принять надлежащие меры для обеспечения того, чтобы насыщение не было достигнуто, ПЦР по конечной точке можно успешно использовать в качестве полуколичественной меры относительных различий в исходных данных матрицы между образцами (см. бюллетень Bio-Rad 2915). Чтобы гарантировать, что реакция находится в экспоненциальной фазе амплификации, образцы можно амплифицировать с увеличивающимся числом циклов, проводить гель-электрофорез и количественно оценивать с помощью устройства для визуализации геля и программного обеспечения. Конкретные методы полуколичественной ПЦР включают относительную ОТ-ПЦР и конкурентную ОТ-ПЦР.

В относительной ОТ-ПЦР две пары праймеров предназначены для мультиплексной реакции ПЦР — одна для интересующего гена, а другая для гена «домашнего хозяйства» (Marone et al. 2001). Пары праймеров должны быть сконструированы так, чтобы не образовывались димеры и образовывались продукты достаточно разной длины, чтобы их можно было различить с помощью гель-электрофореза. Необходимо провести пилотные эксперименты, чтобы проверить продукт после различного количества циклов и определить экспоненциальную фазу реакции для обоих наборов праймеров. Используя программное обеспечение для визуализации геля для определения интенсивности полосы, затем можно рассчитать относительное изменение кратности между образцами, нормализованными по гену домашнего хозяйства. Проблема с этим подходом заключается в том, что гены домашнего хозяйства, необходимые для нормализации, обычно имеют гораздо более высокую экспрессию, чем интересующий ген. Один подход к этой проблеме заключается в использовании генов домашнего хозяйства с более низкой экспрессией и использовании более высоких концентраций праймеров для представляющего интерес гена и более низких концентраций праймеров для гена домашнего хозяйства, чтобы способствовать образованию продукта с более низкой экспрессией.

В конкурентной ОТ-ПЦР экзогенный контроль РНК или ДНК синтезируется и вводится в образцы (Francesco et al.

Learn more

• 
  Ужасные пятки
• 
  Rdw cv в анализе крови повышен
• 
  Продукты улучшающие эрекцию
• 
  Трясет по утрам
• 
  Диффузный пневмосклероз что это
• 
  Что будет если воздерживаться мужчине 1 месяц
• 
  Как проверить легкие и бронхи на онкологию
• 
  Геморрой первой степени
• 
  После ингаляции через сколько можно пить или кушать
• 
  От желудка при беременности
• 
  Запоры при гастрите как избавиться