2011-2017 © МБУЗ ГКП № 7, г.Челябинск.
Масс спектрометрия анализ крови
Анализ микробных маркеров методом газовой хромато-масс-спектрометрии
Определение микроэкологического статуса человека и его отклонений от нормы, в ходе которого осуществляется выявление (уточнение) этиологии инфекционно-воспалительных процессов при любых заболеваниях. Относится к новому направлению в микробиологических исследованиях - диагностике инфекции, дисбиозов и воспалительных процессов по специфическим микробным химическим веществам - маркерам. Исследование универсально в отношении разных групп микроорганизмов: не только бактерий, но и микроскопических грибов и вирусов, в том числе анаэробных микроорганизмов, которые составляют основной микробный массив (до 60 % и более).
Синонимы русские
Микроэкологический статус человека, микробиом человека, микроэкология человека.
Метод исследования
Газовая хроматография масс-спектрометрия (ГХ-ХМС).
Какой биоматериал можно использовать для исследования?
Биоптат, венозная кровь, кал, капиллярная кровь, мазок из зева (ротоглотки), мазок с кожных покровов, мазок с конъюнктивы, мазок из носоглотки, мазок из уретры, мазок из цервикального канала, мокрота, ногти, отделяемое влагалища, отделяемое раны, секрет простаты, слюна, первая порция утренней мочи, средняя порция утренней мочи.
Для исследования почек и мочевого пузыря необходима средняя порция мочи, для исследования воспалительных процессов уретры – первая порция утренней мочи.
Как правильно подготовиться к исследованию?
- Исключить из рациона алкоголь в течение 24 часов до исследования.
- Исключить (по согласованию с врачом) прием мочегонных препаратов в течение 48 часов до сбора мочи.
- Исключить прием слабительных препаратов, введение ректальных свечей, масел, ограничить (по согласованию с врачом) прием медикаментов, влияющих на перистальтику кишечника (белладонна, пилокарпин и др.), и препаратов, влияющих на окраску кала (железо, висмут, сернокислый барий), в течение 72 часов до сбора кала.
Общая информация об исследовании
Микроэкологический статус человека является необходимым условием стабильного функционирования всех его органов и систем. Нормальная микробиота - по сути совокупность микробных сообществ локусов, характеризующихся определенным составом и колонизирующих кожу и слизистые оболочки. Это первичный неспецифический барьер, предшествующий активации неспецифических и специфических факторов защиты макроорганизма. Он покрывает кишечную стенку, слизистые оболочки и кожу человека, насчитывая около ста биллионов клеток микроорганизмов. Микробиота выступает как зеркальный показатель физиологического состояния организма в зависимости от воздействия на него различных факторов. Поэтому так важен контроль - и восстановление микробиоценоза, если он оказывается нарушенным.
Микробиота человека сконцентрирована в основном в кишечнике. Известные сведения о природе микробиоценоза кишечника достаточны для понимания его функционирования как физиологически активного органа человека. Однако при патологиях, связанных с дисбиозом, одних их недостаточно - в таких случаях необходимо количественное определение и контроль изменений в составе микроорганизмов. Отсутствие баланса в их продукции связано с патологическими проявлениями самого разного характера: кишечными расстройствами, кожными заболеваниями, половой дисфункцией, сердечной недостаточностью и др.
Исследование относится к новому направлению в микробиологии – диагностике инфекции, дисбиозов и воспалительных процессов по специфическим микробным химическим веществам (маркерам). Эти вещества содержатся в клеточных стенках микроорганизмов или производятся ими в процессе жизнедеятельности. Маркеры отличаются по химическому строению от вещества клеток человека. В данном случае речь идет о разнообразных жирных кислотах, которых у человека немногим более 20 видов, а у микробов – более 200. Поэтому есть возможность определить наличие микробов в организме человека, если имеется достаточно чувствительный метод анализа. Таким методом является газовая хроматография, совмещенная с масс-спектрометрией (ГХ-МС) - с его помощью можно точно определить химическую природу вещества по его масс-спектру. Современное компьютерное обеспечение в совокупности с разработанными методиками позволяет быстро и надежно определять малые доли веществ микробного происхождения в любых биологических жидкостях человека. Исследование используется для определения инфекционных агентов воспалений и оценки дисбиозов различных локализаций. Суть исследования состоит в прямом извлечении высших жирных кислот из образца биоматериала, их разделения на хроматографе в капиллярной колонке высокого разрешения и анализе состава на масс-спектрометре. На основании этих измерений расшифровывается состав микробиоты.
Применение данного метода для изучения микроэкологии человека дает качественно новый вариант микробиологического исследования благодаря возможности одновременного количественного определения большого количества микробных маркеров непосредственно в биологических пробах без предварительного культивирования микроорганизмов и использования биохимических тестовых материалов и генетических праймеров. Получение в реальном времени расширенной информации об анаэробах и труднокультивируемых аэробах, а также актинобактериях, вирусах, дрожжах и микроскопических грибах из одной пробы обеспечивает полную картину микробной этиологии заболевания. Количественные измерения позволяют изучать динамику изменения микробиоты при лечебных мероприятиях, в том числе влияние антибиотиков и пробиотиков на пристеночную микробиоту кишечника.
В ходе исследования определяется более 56 микроорганизмов одновременно в одном анализе; при этом используется количественный экспресс-метод диагностики дисбактериозов и определения возбудителей инфекции. Анализ универсален в отношении разных групп микроорганизмов: бактерий, грибов, вирусов. Чувствительность составляет 104-105 клеток в пробе; селективность – до вида при наличии маркера. Анализ осуществляется непосредственно в материале без высевания микрофлоры и не требует биологических и биохимических тестовых материалов – культуральных сред, ферментов, праймеров и т.п.
Когда назначается исследование?
- При определении микроэкологического статуса организма и его отклонений;
- при выявлении или уточнении этиологии инфекционно-воспалительного процесса при любых нозологических формах заболеваний в клинической практике:
- ОРИТ: сепсис, гнойно-воспалительные очаги, лихорадка неясной этиологии, менингит, бактериурия, полиорганная недостаточность;
- хирургия: инфекция вследствие хирургического вмешательства, абсцессы почек и печени, воспалительные процессы респираторных органов, воспаление внутренних половых органов, ожоговая инфекция, гангрена, перитонит, синовит;
- гинекология: хронический вагинит, цистит, воспаление матки и придатков, кандидоз;
- урология и андрология: пиелонефрит, буллезный цистит, уретрит, простатит, орхит, гонорея;
- репродуктология: мужское и женское бесплодие, связанное с инфекциями половых органов, невынашивание беременности, бесплодие, хронические воспалительные заболевания;
- гастроэнтерология: синдром раздраженного кишечника, гастрит, дисбактериоз, диарея, запор, болезнь Крона;
- пульмонология: муковисцидоз, пневмония, туберкулез, плеврит, лихорадка неясного генеза;
- ЛОР: гайморит, синусит, фарингит, отит;
- гепатология: асцит, дисбактериоз, спонтанный бактериальный перитонит;
- дерматовенерология: угревая болезнь, атопическая экзема, себорея, онихомикоз, псориаз, дерматиты неясной этиологии, сифилис.
Что означают результаты?
Результат исследования выдается в виде списка исследуемых микроорганизмов, допустимых значений нормы и отклонений от нормы, а также диаграммы в сопоставлении с нормой.
+ Прилагается заключение в виде справочной информации по результатам анализа.
Для биоматериалов кал, моча, секрет простаты и мазок из уретры нет референсных значений.
Определение микробиоценоза (по Осипову) методом хромато-масс-спектрометрии (МСММ) - Микробиоценоз по Осипову - Комплексы медицинских анализов и их цен в KDL
Выберите требуемый вид биоматериала
Взятие материала на исследование возможно только врачом соответствующей квалификации.
Кровь можно сдавать в течение дня, не ранее, чем через 3 часа после приема пищи или утром натощак. Чистую воду можно пить в обычном режиме.
Накануне исследования не применять местные лекарственные препараты и процедуры, исключить половой акт. При взятии соскоба из уретры не мочиться в течение 1,5-2 часов до процедуры.
В течение суток перед исследованием не применять местные антисептики и антибиотики, в течение 2 часов исключить любые местные процедуры (полоскания, спреи, капли, мази)
Мокроту можно собрать только при наличии кашля! Перед сбором мокроты рекомендуется почистить зубы (не использовать зубную пасту с антибактериальными компонентами) и прополоскать рот кипяченой водой. Избегать попадания в мокроту слюны и носовой слизи. Мокрота по мере откашливания собирается в стерильный контейнер. Кашель можно вызвать с помощью нескольких глубоких вдохов.
Используется средняя порция утренней мочи. Перед сбором мочи проводится тщательный туалет наружных половых органов без использования антибактериального мыла и антисептиков.
Взятие материала на исследование возможно только врачом соответствующей квалификации.
Взятие материала на исследование возможно только врачом соответствующей квалификации.
Взятие материала на исследование возможно только врачом соответствующей квалификации.
Пациент собирает материал самостоятельно путем мастурбации в стерильный контейнер.
Кровь можно сдавать в течение дня, не ранее, чем через 3 часа после приема пищи или утром натощак. Чистую воду можно пить в обычном режиме.
пациент собирает материал самостоятельно в стерильный контейнер.
Взятие материала на исследование возможно только врачом соответствующей квалификации.
ХМС-анализ крови по Осипову (хромато-масс-спектрометрия)
Метод ХМС
Данный метод представляет новое направление в микробиологии, а именно диагностике инфекций и воспалений по маркерам (микробные химические вещества). Они содержатся в микроорганизмах или формируются ими. Принцип диагностики по маркерам состоит в том, что они существенно отличаются по строению от клеток человека. К примеру, у человека жирных кислот больше 20 видов, а у микробов порядка 200, поэтому выявить наличие микробов в организме человека не составляет особого труда.
Хромо-масс-спектрия оснащена современной техникой, что в совокупности с высокой чувствительностью и прочими достоинствами метода позволяет точно и в короткие сроки выявить даже малые доли микробиологических веществ в жидкости человеческого организма и окружающей среде.
Анализ методом ХМС
ХМС-анализ прекрасно зарекомендовал себя специалистами различных направлений, таких как:
- Гинекология;
- Репродуктология;
- Урология;
- Гастроэнтерология и др.,
Как самостоятельный анализ, так и дополнение к традиционным методам обследования.
Данный анализ играет огромную роль при лечении таких заболеваний как:
- Заболевания кожного покрова;
- Заболевания пищеварительной системы;
- Хронические воспалительные процессы;
- Непереносимость продуктов.
Забор крови можно производить в любое время суток, независимо от приема пищи и других факторов.
Преимуществам метода ХМС:
- Выявление более 50 микроорганизмов в рамках одного анализа
- Универсален в отношении грибов, бактерий и вирусов
- Высокая чувствительность клеток в пробе
- Избирательность до вида (если присутствует маркер)
- Не требует наличия тестовых материалов, таких как: культурная среда, праймеры, ферменты и др.
- Анализ производится в самом материале, без дополнительной подготовки.
К достоинствам методики Хромато-масс-спектрометрии (ХМС) микробных маркеров, можно отнести:
- Хроматография масс-спектрометрия является точным и высокочувствительным методом анализа;
- В рамках одного анализа выявляются различные виды микроорганизмов, которые могут являться участниками воспалительных процессов;
- В отличие от традиционных методов диагностики ХМС выявляет целый спектр микробов, которые обычно остаются без внимания. Впоследствии чего пациент остается не до конца обследованным, что может привести к последствиям.
- Методика уникальна в том плане, что выявляет даже «спящих» возбудителей болезни.
- Метод считается универсальным, поскольку применяется для обследования и выявления микроорганизмов в любых органах.
В настоящее время всё больше и больше научных исследований приводят к выводам, что причины более 90% всех известных болезней человека кроется в больном кишечнике. Человеческий организм населяет более 100 триллионов микроорганизмов, которые покрывают все тело человека снаружи и внутри: находятся на коже, в ушах, в носоглотке, в кишечнике, в половой системе человека, на протяжении всего пищеварительного тракта. Все это многообразие можно назвать микробиотой.
Большая часть микроорганизмов населяет пищеварительный тракт: грибки, вирусы, бактерии. Вес всех бактерий, обитающих в кишечнике, составляет порядка 1,5-1,8 кг.
Микрофлора кишечника принимает участие в самых разных физиологических процессах: всасывание питательных веществ, функционирование пищеварительной системы, синтез витаминов, расщепление белков, жиров и углеводов и др. Состояние кишечника влияет на метаболизм, настроение человека, состояние иммунной системы.
Если наша микрофлора здорова, то в ней доминируют полезные хорошие бактерии, мы чувствуем себя хорошо, все наши системы организма работают хорошо, мы не болеем, не страдаем от аллергических реакций, не имеем заболеваний ЖКТ и заболеваний нервной системы, нас не мучают запоры или диарея, у нас нет проблем с памятью и концентрацией внимания. В противном случае в микрофлоре преобладают патогенные микроорганизмы. И наше здоровье и долголетие под огромной угрозой.
Для организации процесса оздоровления и омоложения а так же и в лечении болезней ни как нельзя пренебрегать интересами и влиянием микробиоты.
На сегодня лучшим методом для контроля микробиоты является метод нашего Российского ученого Доктора биологических наук Георгия Осипова. Наш ученый обогнал в своих исследованиях американцев из Университета штата Теннесси (Ноксвилл). Никто кроме профессора Осипова не смог разработать методику масштабного количественного видового анализа микробных сообществ в медицине по микробным маркерам и суммарным профилям жирных кислот.
Работе доктора биологических наук профессора Георгия Осипова предшествовали многочисленные исследования последних двадцати лет отечественных и зарубежных ученых, это труды C.W. Moss, E.Jantzen, D.B. Drucker, C.Asselineau, M.Goodfellow, D.E.Minnikin за рубежом, З.П.Васюренко, Л.В.Андреева, В.И.Седова, С.Г.Батракова, Б.В.Розынова, Е.А.Киприановой и других в России и бывшем СССР.
Методология анализа микробных сообществ методом Газовой Хроматографии Масс-Спектрометрии была опубликована как в отчете по теме гранта Минэкологии РФ «Экологическая безопасность России», так и в последовавшем описании патента на способ анализа.
Она распространена при поддержке академиков РАМН Ю.Ф. Исакова и А.А.Воробьева и проф. Н.В.Белобородовой на диагностику воспалительных процессов и дисбиозов в клинической практике.
Суммарно метод в приложении к экологическим, биотехнологическим и клиническим проблемам изложен в докторской диссертации Г.А. Осипова (1996), пяти кандидатских диссертациях, статьях в отечественной и зарубежной периодике, пособиях для врачей.
Исследование осуществляется в Лаборатории в течение 5 рабочих дней.
Вместе с результатом анализа пациент получает распечатку программы оздоровления на 3 месяца с учетом его микробиоты
Врачи клиники рекомендуют прочесть статью про новую услугу Profhilo
| Аллергические исследования |
| Казеин Ig E |
| Казеин Ig G |
| Аминокислоты и их метаболиты |
| Аминокислоты в крови: экспертное количественное исследование (48 показателей) |
| Аминокислоты в плазме крови: скрининговое полуколичественное исследование для лиц старше 18 лет (13 показателей) |
| Аминокислоты и ацилкарнитины: скрининговое полуколичественное исследование для диагностики НБО у новорожденных и детей до 2-х лет (26 показателей) |
| Метиллированные производные аргинина в плазме крови (ADMA, SDMA) |
| Органические кислоты - скрининговое выявление лабораторных признаков наследственных болезней обмена у новорожденных и детей до 2-х лет(40 показателей) в моче |
| Органические кислоты – выявление функциональных метаболических изменений(60 показателей) в моче |
| Биохимические исследования |
| АЛТ |
| АСТ |
| Альбумин |
| Амилаза |
| Билирубин общий |
| Билирубин прямой |
| Билирубин непрямой |
| Гамма-ГТ |
| Глюкоза |
| Гликированный гемоглобин HbA1c |
| Фруктозамин |
| Креатинкиназа |
| Креатинкиназа-МВ |
| Миоглобин |
| Креатинин |
| Липаза |
| ЛДГ общая |
| Мочевина |
| Мочевая кислота |
| Общий белок |
| Белковые фракции (заказ вместе с общим белком) |
| Триглицериды |
| Холестерин общий (ХС) |
| Холестерин –ЛПВП (альфа-холестерин) |
| Холестерин –ЛПНП (бета-холестерин) |
| Комплексный анализ обмена холестерина+индекс атерогенности |
| АПО-ЛП-А1 |
| АПО-ЛП-Б |
| Холинэстераза |
| Фосфатаза кислая |
| Фосфатаза щелочная |
| Кальций |
| Na/K/Cl в крови |
| Магний |
| Фосфор неорганический |
| Антистрептолизин-О (АСЛ-О) полуколичественный |
| С-реактивный белок ультрачувствительный |
| Ревматоидный фактор (полуколичественный) |
| Железо свободное, белковосвязанное |
| Латентная железосвязывающая способность (ЛЖСС) |
| Общая железосвязывающая способность сыворотки (ОЖСС) |
| Трансферрин |
| Ферритин |
| Эритропоэтин |
| А1-антитрипсин |
| Церулоплазмин |
| Ионизированный кальций |
| Тимоловая проба |
| Молочная кислота (лактат) |
| Гаптоглобин |
| Липопротеин-(а) |
| %НТЖ (вместе с железом+ЛЖСС) |
| Холестерин липопротеидов очень низкой плотности (ЛПОНП) |
| Эозинофильный катионный белок (ЭКБ) |
| Амилаза панкреатическая |
| Лактатдегидрогеназа 1,2 (ЛДГ) |
| Мозговой натрийуретический пептид В (BNP) |
| Витамины |
| Бета-каротин, в крови |
| Витамин В2 (рибофлавин), в плазме крови |
| Витамин В2 (ФАД), в плазме крови |
| Витамин В6 (пиридоксаль-5-фосфат), в плазме крови |
| Витамин В7 (биотин), в плазме крови |
| Витамин D: 25-OH D2 и 25-OH D3 РАЗДЕЛЬНО |
| Витамин D: 25-OH D2 и 25-OH D3 СУММАРНО |
| Витамин А (ретинол), в крови |
| Витамин В1 (тиамин), в цельной крови |
| Витамин В12 (цианокобаламин), в крови |
| Витамин В2 (рибофлавин), в цельной крови |
| Витамин В3 (ниацин), в плазме крови |
| Витамин В5 (пантотеновая кислота), в плазме крови |
| Витамин В6 (пиридоксин), в цельной крови |
| Витамин В9 (фолиевая кислота), в крови |
| Витамин Е (токоферол), в крови |
| Витамин К1 (филлохинон), в крови |
| Витамин С (аскорбиновая кислота), в крови |
| Витамины В9 (фолиевая кислота) и В12, в крови |
| Витамины группы В: B1, B2(ФАД), B3, B5, B6, В7, B9, B12, в крови |
| Витамины группы В: В1 (тиамин-пирофосфат), В2 (ФАД), В6 (пиридоксаль-5-фосфат), в цельной крови; В2 (ФАД), В2 (рибофлавин), В3 (ниацин), В5 (пантотеновая кислота), В6 (пиридоксаль-5-фосфат), В7 (биотин), в плазме крови; (внутриклеточные и внеклеточные формы |
| Витамины группы В: В1 (тиамин-пирофосфат),В2 (ФАД), В6 (пиридоксаль-5-фосфат), в цельной крови |
| Витамины группы В: В2 (ФАД), В2 (рибофлавин), В3 (ниацин), В5 (пантотеновая кислота), В6 (пиридоксаль-5-фосфат), В7 (биотин), в плазме крови |
| Жирорастворимые и водорастворимые витамины - расширенное профильное исследование: А,D (25-OH D2/D3 суммарно),E,K1,C,B1,B2, B3,B5,B6,В7,B9,B12 – в крови |
| Жирорастворимые витамины: A (ретинол), D(25-ОН-D2/D3 суммарно), E (альфа-токоферол), K (филлохинон) – в крови |
| Генетические исследования |
| Диагностика синдрома Жильбера (мутация гена UGT1) |
| Генетический тест на лактозную непереносимость (МСМ6) |
| Генетические дефекты ферментов фолатного цикла (MTHRF, MTR, MTRR-4 точки) |
| Гормональные исследования |
| 17-OH-прогестерон |
| Beta-Cross laps |
| T-Uptake (тироксин связывающая способность в сыворотке человека) |
| АКТГ |
| АМГ (антимюллера гормон) |
| Андростендион |
| Андростендион глюкуронид |
| Антитела к тиреоглобулину (АТ-ТГ) |
| Антитела к тиреопероксидазе (АТ-ТПО) |
| АТ к рецепторам ТТГ (АТ к рТТГ) |
| Гастрин |
| Гомоцистеин |
| ГСПГ (глобулин связывающий половые гормоны) |
| Дигидротестостерон |
| ДЭА-сульфат |
| Ингибин-Б |
| Инсулин |
| ИФР-1 - инсулинозависимый фактор роста (соматомедин-С) |
| Кортизол (кровь) |
| Кортизол (суточная моча) |
| ЛГ (лютеинизирующий гормон) |
| Лептин |
| Паратгормон |
| ПРГ (прогестерон) |
| ПРЛ (пролактин) |
| Проинсулин |
| Ренин |
| Свободный бета-ХГЧ |
| Свободный эстриол |
| С-пептид |
| СТГ (соматотропный гормон) |
| Тестостерон общий |
| Тестостерон свободный |
| Тиреоглобулин |
| ТТГ |
| Т3 свободный |
| Т4 свободный |
| Тропонин Т (высокочувствительный) |
| Тропонин I |
| ФСГ (фолликулостимулирующий гормон) |
| Эстрадиол |
| Гормональный профиль для мужчин |
| Гормональный профиль для женщин |
| Иммунологические исследования |
| Иммунограмма расширенная |
| Иммунограмма-скрининг |
| Интерлейкин 1b |
| Интерлейкин 6 |
| Интерлейкин 8 |
| Комплексная оценка иммунного статуса (субпопуляции лимфоцитов, фагоцитоз/, иммуноглобуллины) |
| ФНО (фактор некроза опухоли) |
| Карнитины и жирные кислоты |
| Ацилкарнитины в моче: скрининговое полуколичественное исследование |
| Ацилкарнитины в плазме крови: скрининговое полуколичественное исследование для лиц старше 18 лет |
| Омега – 3 индекс |
| Полиненасыщенные жирные кислоты семейства Омега-3 и Омега-6 в цельной крови |
| Полиненасыщенные жирные кислоты семейства Омега-3 и Омега-6 в сыворотке крови |
| Развернутая обобщенная оценка мембранного и мобильного пулов жирных кислот в цельной крови |
| Развернутая оценка мобильного пула жирных кислот в цельной крови |
| Комплексная оценка системы гемостаза |
| Фактор Виллебранда |
| Маркеры аутоиммунных заболеваний |
| ЭЛИ-висцеро тест 24 (кровь) |
| Антитела к эндомизию (глиадину) |
| Маркеры микробиома |
| Короткоцепочечные жирные кислоты (КЦЖК) в моче (10 показателей): уксусная кислота (ацетат, С2), пропионовая кислота (пропионат, С3), масляная кислота (бутират, С4), валериановая кислота (валерат, С5), капроновая кислота (капронат, С6), непатновая кислота (С7), изомасляная кислота (изобутират, iС4), изовалериановая кислота (изовалерат, iС5) |
| Микроэлементы |
| Йод в моче |
| Токсичные микроэлементы и тяжелые металлы: Hg, Cd, As, Li, Pb, Al (6 элементов) в волосах |
| Токсичные микроэлементы и тяжелые металлы: Hg, Cd, As, Li, Pb, Al (6 элементов) в крови |
| Токсичные микроэлементы и тяжелые металлы: Hg, Cd, As, Li, Pb, Al (6 элементов) в моче |
| Эссенциальные и токсичные микроэлементы (10 элементов) в цельной крови |
| Эссенциальные и токсичные микроэлементы (13 элементов) в волосах |
| Эссенциальные и токсичные микроэлементы (13 показателей) в крови |
| Эссенциальные и токсичные микроэлементы (13 показателей) в моче |
| Эссенциальные и токсичные микроэлементы (15 элементов) в цельной крови |
| Эссенциальные и токсичные микроэлементы (19 элементов) в цельной крови |
| Эссенциальные и токсичные микроэлементы (23 показателей) в крови |
| Эссенциальные и токсичные микроэлементы (23 показателей) в моче |
| Эссенциальные и токсичные микроэлементы (23 элемента) в волосах |
| Эссенциальные и токсичные микроэлементы (40 элементов) в волосах |
| Эссенциальные и токсичные микроэлементы (40 показателей) в крови |
| Эссенциальные и токсичные микроэлементы (40 показателей) в моче |
| Эссенциальные и токсичные микроэлементы в волосах (23 показателя) экспертное исследование |
| Нейромедиаторы: Биогенные амины и их метаболиты |
| Биогенные амины: адреналин, норадреналин, дофамин, и их метилированные метаболиты: общие метанефрин и норметанефрин (свободные и конъюгированные с SO4) и конечные метаболиты катехоламинов и серотонина: гомованилиновая кислота (ГВК), ванилилминадальная кистлота (ВМК), 5-оксииндолуксусная кислота (5-ОУИК) с пересчетом на концентрацию креатинина у лиц старше 18 лет (разовая порция мочи) |
| Биогенные амины: адреналин, норадреналин, дофамин, серотонин - в крови; и их метаболиты – в моче) |
| Биогенные амины и их метиллированные метаболиты в моче |
| Биогенные амины: адреналин, норадреналин, дофамин (в суточной моче) |
| Биогенные амины: адреналин, норадреналин, дофамин и их метаболиты и метаболит серотонина в моче |
| Биогенные амины: адреналин, норадреналин, дофамин, серотонин и их метилированные метаболиты в крови |
| Биогенные амины: адреналин, норадреналин, дофамин, серотонин (в крови) |
| Гистамин |
| Метаболиты адреналина и норадреналина: метанефрин, норметанефрин (свободные и коньюгированные с SO4) в моче |
| Метаболиты адреналина и норадреналина: свободные метанефрин и норметанефрин; общие метанефрин и норметанефрин в моче |
| Метаболиты биогенных аминов: гомованилиновая кислота, ванилин-миндальная кислота, 5-окси-индолуксусная кислота (в моче) |
| Свободные фракции метанефрина и норметанефрина (в крови) |
| Свободные фракции метанефрина и норметанефрина (в суточной моче) |
| Серотонин (в крови) |
| Общеклинические анализы |
| Клинический анализ с лейкоцитарной формулой (5DIFF) |
| СОЭ |
| «Инсулинорезистентность» (глюкоза, инсулин, индекс HOMA, индекс CARO) |
| Оксидативный стресс |
| Глутатион свободный |
| Коэнзим Q10 |
| Малоновый диальдегид (стабильный конечный продукт ПОЛ)в крови |
| Гуанозины: маркеры оксидативного повреждения нуклеиновых кислот (8-OHdG, 8-OHG, 8-OHGua) в моче |
| Оксидативный стресс (7 показателей): малоновый диальдегид, антиоксиданты: коэнзим Q10, вит. Е, вит. С, бета-каротин, глутатион – в крови) |
| Оксидативный стресс: оценка интенсивности свободно-радикальных процессов (FORT), антиоксидантной емкости (FORD) и стадийности процесса |
| Онкомаркеры |
| Нейроспецифическая енолаза (НСЕ) |
| Стероидные гормоны и нейромедиаторы |
| Андрогены и их метаболиты (8 показателей) в моче |
| ДГЭА |
| Кортизол (утренняя, дневная, вечерняя и ночная порции-4 порции), ДГЭА, соотношение кортизола и ДГЭА, выявление стресса и его стадии (слюна) |
| Кортизол (утренняя, дневная, вечерняя и ночная порции-6 порций), ДГЭА, соотношение кортизола и ДГЭА, выявление стресса и его стадии (слюна) |
| Кортизол в слюне (одна порция) |
| Кортизол в слюне (утренняя порция в 8:00 и вечерняя порция в 23:00) |
| Кортизол, кортизон и 6-гидроксикортизол и их соотношение (в моче) |
| Мелатонин в слюне (ночная порция 2:00-3:00) |
| Мелатонин в слюне (суточный ритм секреции (утренняя, дневная, вечерняя, ночная порции) |
| Мелатонин сульфат в моче |
| Метаболиты эстрогенов расчет соотношений (оценка риска развития онкологии) в моче |
| Стероидный профиль(4 показателя): андрогены, глюкокортикоиды, эстрогены, прогестагены в слюне |
| Стероидный профиль(13 показателей): андрогены, глюкокортикоиды, минералокортикоиды, эстрогены, прогестагены и их предшественники метаболиты в слюне |
| Стероидный профиль (8 показателей): андрогены, глюкокортикоиды, эстрогены, прогестагены и их предшественники метаболиты в слюне |
| Андрогены и их метаболиты расчет соотношений, эстрогены и прогестагены (12 показателей) в моче |
| Стероидный профиль (12 показателей): андрогены, глюкокортиокиды, минералокортикоиды, прогестагены, их предшественники и метаболиты (в крови) |
| Стероидный профиль (13 показателей): андрогены, глюкокортикоиды, минералокортикоиды, прогестагены, их предшественники и метаболиты ПЛЮС (в крови) |
| Стероидный профиль (16 показателей): андрогены, глюкокортикоиды, минералокортикоиды, эстрогены, прогестагены, их предшественники и метаболиты (в крови) |
| Стероидный профиль (17 показателей): андрогены, глюкокортикоиды, минералокортикоиды, эстрогены, прогестагены, их предшественники и метаболиты (в крови) |
| Эстрогены и их метаболиты (9 показателей) расчёт соотношений (в моче) |
| Эстрогены и прогестагены (4 показателя): эстрадиол, эстрон, эстриол и прегнандиол (в моче) |
| Эстрогены: эстрадиол, эстрон, эстриол |
| Токсикологические исследования |
| Скрининговое выявление наркотических и психоактивных веществ в моче с идентификацией их групповой принадлежности (моча разовая) |
| Высокоспецифичное выявление наркотических, психоактивных веществ и маркеров «вредных привычек» в моче с их точной идентификацией (моча разовая) |
Сдать анализ на Анализ микробных маркеров методом газовой хромато-масс-спектрометрии (по Осипову) в Пермь быстро и дешево в
Если вы в текущем или трех предшествующих годах оплачивали медицинские услуги в ООО «МедЛабЭкспресс» за себя и/или ближайших родственников (супругу (а), родителей, детей (в том числе усыновленных и/или подопечных) в возрасте до 18 лет), и при этом, в этих периодах у вас были доходы, с которых был удержан НДФЛ по ставке 13%, то у вас есть право вернуть из бюджета 13% от суммы, оплаченной за наши медицинские услуги. Данный вычет предусмотрен пп.3 п.1 ст.219 Налогового кодекса РФ.
Для того чтобы заказать документы, подтверждающие ваше право на получение такого вычета, вам необходимо обратиться в любой удобный для вас пункт ООО «МедЛабЭкспресс» с заявлением, бланк которого прилагается. Бланк заявления также может предоставить регистратор пункта. Вы можете заполнить его заранее или прямо на пункте.
При этом, к заявлению желательно приложить копии документов, подтверждающие оплату (касс.чеки, бланки строгой отчетности).
Вы также можете направить файл заполненного заявления на электронную почту [email protected]
Внимательно заполняйте все необходимые поля заявления:
- налоговый период (год), в котором оплачены услуги
- Ф.И.О. (полностью), ИНН, дата рождения плательщика (получателя вычета), то есть лица, которое планирует обратиться в налоговую инспекцию за вычетом.
- Ф.И.О. (полностью), ИНН, дата рождения родственника, если услуги оплачивались за супругов, родителей, детей (до 18 лет).
В течение 3 (трех) рабочих дней после обращения вам будут подготовлены следующие документы:
- Справка об оплате медицинских услуг для представления в налоговые органы РФ по форме, установленной Приказом Минздрава РФ N 289, МНС РФ N БГ-3-04/256 от 25.07.2001
- Копия договора с указанием информации о лицензии на мед.деятельность
- Копия лицензии (при условии получения запроса на ее предоставление).
Внимание:
- Для получения готового пакета документов необходимо иметь при себе документ, удостоверяющий личность (паспорт гр.РФ)
- Справки не выдаются на услуги, оплаченные за прочих родственников, не перечисленных выше.
- О необходимости получения копии лицензии предупреждайте регистратора заранее
Аналитика - научно-технический журнал - Аналитика
Масс-спектрометрия (МС) принадлежит к числу наиболее информативных и активно развивающихся методов химического анализа. Сегодня без использования МС не обходятся как самые передовые исследования в области материаловедения и наук о жизни, так и рутинные анализы: от мониторинга состояния окружающей среды и состава пищевых продуктов до медицинской диагностики. На выставке analytica 2016 ведущие мировые производители представили новейшие разработки в области масс-спектрометрии.
Немецкая компания Analytik Jena AG специализируется на разработке приборов оптической спектроскопии и элементного анализа и входит в число ведущих европейских производителей высокоточного аналитического оборудования. На выставке analytica 2016 она представила новый ИСП-МС PlasmaQuant MS Elite. Об этом приборе нам рассказал начальник проектно-конструкторского отдела Analytik Jena AG Юрий КАЛИНИЧЕНКО."Масс-спектрометр с индуктивно-связанной плазмой PlasmaQuant MS принадлежит к числу последних разработок Analytik Jena. Мы впервые представили его на рынке в 2015 году. Конструкция прибора включает целый ряд инновационных разработок, благодаря которым стала возможной работа в интервале 3–260 а.е.м. в широком линейном динамическом диапазоне (1010) с чувствительностью до 1,5·109 имп./с/мг/л.
Инструмент конструктивно состоит из двух частей – плазменной и вакуумированной масс-спектрометрической. Прежде всего, отмечу ряд интересных особенностей плазменной системы. Она позволяет работать с вдвое меньшим расходом аргона (7–10 л/мин.) по сравнению с другими приборами на рынке. Такая возможность очень интересна для лабораторий, выполняющих множество рутинных анализов, поскольку позволяет снизить эксплуатационные расходы. Кроме того, благодаря новому ВЧ-генератору Eco Plasma, плазма отличается высокой долговременной стабильностью. ВЧ-генератор обеспечивает симметричный двухполярный сигнал возбуждения ("земля" в центре колебаний сигнала). В результате формируется электрически сбалансированная, квазинейтральная плазма, что устраняет проблему вторичной ионизации, конструкция горелки не требует экрана. В плазму можно добавлять и другие газы (кислород, азот, гелий) с помощью автоматического контроллера потоков газа Nitrox. Все это позволяет достаточно легко работать с очень сложными матрицами, в том числе – с органическими образцами.
Пучок ионов пропускается через встроенную реакционно-коллизионную ячейку (iCRC). Она располагается в вершине конуса скиммера перед входом в зону высокого вакуума. В ячейку подаются водород и гелий (соответственно, реакционный и коллизионный газы). Они взаимодействуют с полиатомными ионами, которые теряют кинетическую энергию и выводятся из системы, не попадая далее в зону ионной оптики. Это позволяет в еще большей степени устранять матричные помехи и ионные наложения.
Не менее примечательна масс-спектрометрическая часть нашего прибора. В нем используется квадрупольный масс-фильтр с частотой 3 МГц и очень быстрой интеграцией сигнала – до 50 мкс. Это обеспечивает быстрое сканирование спектра и позволяет использовать прибор, например, совместно с лазерной абляцией или для анализа единичных частиц. Масс-фильтр позволяет определять все известные стабильные изотопы в диапазоне от 3 до 260 а.е.м.
Мы выпускаем две модели PlasmaQuant MS – базовую и продвинутую (Elite). Особо отмечу, что даже в базовой конфигурации PlasmaQuant MS – самый чувствительный квадрупольный ИСП-МС на рынке. А у модели PlasmaQuant MS Elite чувствительность еще выше – порядка 1,5 · 109 имп./с/мг/л, что более характерно для магнитных ИСП-МС-систем. Конечно, речь идет именно о чувствительности, а не о разрешении масс – все же это квадруполь. Однако выдающаяся чувствительность делает PlasmaQuant MS идеальным инструментом для исследовательских приложений.
Система PlasmaQuant MS Elite эффективна для анализов следовых концентраций (ppb, ppt), особенно при совместном использовании с такими методами, как пробоотбор посредством лазерной абляции или предварительное разделение с помощью ВЭЖХ. При этом концентрации образцов, благодаря высокому динамическому диапазону, могут быть очень велики. Сочетание чувствительности и динамического диапазона очень важно в таких задачах, как измерения изотопных отношений, например, в атомной промышленности, в геологии для определения возраста пород и т.п.
За счет чего достигаются столь высокая чувствительность и динамический диапазон? Прежде всего, наше уникальное решение – система ввода ионов в масс-спектрометрическую систему на основе ионного зеркала ReflexION[1].
Оно отражает ионный пучок точно под углом 90°, а нейтральные частицы и фотоны сохраняют прямолинейное движение. В результате нейтральные частицы попадают в турбомолекулярный вакуумный насос Pfeiffer HiPace300, а ионы фокусируются в плотный пучок диаметром 1 мм на входе в квадруполь. Тем самым радикально уменьшается уровень фоновых шумов. Дополнительно он снижается менее чем до 1 имп./с с помощью несоосных S-образных стержней Брубакера на входе в квадрупольный масс-анализатор.
Другая ключевая особенность МС-системы нашего прибора – уникальный цифровой импульсный детектор ADD10 с электронным умножителем ETP AF250с. Обычно детекторы в ИСП-МС работают в двух основных режимах: для низких концентраций – в цифровом режиме счета импульсов, для более высоких, когда интенсивность сигнала становится значительной, – в аналоговом режиме. Такой подход требует калибровки перехода от цифрового к аналоговому режиму, причем, как правило, каждый день. В нашем случае детектор полностью цифровой. В нем между электронным умножителем и выходным усилителем используется аттенюатор, который полностью автоматически регулирует линейность сигнала в диапазоне до 10 порядков величины. Это не просто обеспечивает широкий динамический диапазон, но и увеличивает срок службы детектора.
Для управления прибором и гибкой настройки рабочих параметров в режиме реального времени предназначено программное обеспечение ASpect MS.
Особо отмечу удобную конструкцию PlasmaQuant MS. Прибор весьма компактен, на столе он занимает площадь всего 0,4 м2. Можно открыть инструмент как книжку и получить легкий доступ к конусу интерфейса МС-системы, например, для чистки или замены. Собственно, все не вакуумируемые части прибора легкодоступны для технического обслуживания.
В целом, система PlasmaQuant MS эффективна в широчайшем спектре применений, от задач экологического мониторинга и анализа объектов окружающей среды и до технологического контроля в промышленности и анализа биологических материалов".
Shimadzu – один из крупнейших мировых производителей аналитического, рентгеновского и испытательного оборудования. История компании насчитывает почти полтора столетия. Корпорация имеет около 70 подразделений по всему миру, а также несколько собственных представительств и широкую сеть дилеров в России и странах СНГ. Shimadzu производит практически весь спектр аналитического оборудования – жидкостные и газовые хроматографы и хромато-масс-спектрометры, масс-спектрометры MALDI и масс-микроскопы, спектрометры для элементного анализа, оптические и ИК-фурье-спектрофотометры, биотехнологическое оборудование.
Научные исследования и разработка нового оборудования занимает одно из главных мест в деятельности компании. Shimadzu имеет сеть собственных исследовательских центров и, кроме того, тесно сотрудничает с ведущими научными лабораториями всего мира. Сотрудник корпорации Shimadzu Коити Танака (Koichi Tanaka) в 2002 году получил Нобелевскую премию за создание метода мягкой лазерной десорбции (soft laser desorption, SLD).
В марте этого года компания Shimadzu впервые представила масс-спектрометр с индуктивно связанной плазмой ICP-MS 2030 – элементный анализатор, определяющий содержание большинства элементов на уровне триллионных долей (ppt). О новом приборе нам рассказал менеджер по спектроскопической продукции Европейского отделения компании Shimadzu, д-р Йохан ЛЯЙНДЕРС (Johan Leinders).
"Масс-спектрометрия с индуктивно связанной плазмой (ИСП-МС) – один из универсальных методов анализа элементного состава вещества. Cтабильность ионного источника и высокая эффективность ионизации любых элементов делает метод незаменимым не только для определения самих элементов, но и для анализа их изотопного состава.
Cпектрометр Shimadzu ICP-MS 2030 воплотил в себе весь опыт, накопленный компанией в разработке спектрометров с индуктивно-связанной плазмой (в частности, ИСП-ОЭС) и масс-спектрометрической техники. Наши инженеры потратили долгое время на его разработку – наконец, в марте этого года спектрометр был представлен на выставке Pittcon. Как и все аналитическое оборудование ведущих японских фирм, прибор отличается высокой надежностью и продуманностью каждой детали.
Основная задача разработчиков, с которой они успешно справились – создание высокочувствительного прибора, отвечающего современным требованиям определения микроэлементов. Новый спектрометр определяет большинство элементов на уровне триллионных долей (ppt) и даже ниже. Он соответствует требованиям ICH Q3D, регламентирующим предельное содержание примесей токсичных элементов в фармацевтической продукции, а также другим международным стандартам, в том числе тем, которые вступят в действие в ближайшие годы.
Высокую чувствительность обеспечивают особенности как аппаратной части прибора, так и программного обеспечения. Прежде всего, это октупольная соударительная ячейка, эффективно удаляющая из ионного потока интерферирующие компоненты: молекулярные ионы, нейтральные частицы и т.д. Ячейка заполняется газообразным гелием. Сталкиваясь с атомами гелия, мешающие частицы теряют больше кинетической энергии, чем ионы аналитов. На выходе из ячейки присутствует потенциальный барьер, через который проходят только частицы с кинетической энергией не ниже определенной, то есть только анализируемые ионы. Использован принцип дискриминации по кинетической энергии (Kinetic Energy Discrimination, KED).
Частая причина потери чувствительности – прямое попадание эмиссионного излучения плазмы непосредственно на детектор. Во избежание этого, поток ионов направляется по искривленной траектории. Сразу за соударительной ячейкой расположена система ионных линз, которая не просто фокусирует пучок ионов, но и отклоняет его на определенный угол. Усовершенствован и сам детектор: он представляет собой фотоэлектронный умножитель, где ионы попадают сразу на рабочую поверхность активных динодов. Таким образом, наш прибор обеспечивает не только высочайшую чувствительность, но и динамический диапазон в девять порядков величины. Диапазон измеряемых масс составляет от 5 до 260 а.е.м. – этого достаточно для определения любых элементов от лития до урана.
Программное обеспечение включает два особых модуля, называемых "помощниками": помощник создания метода и помощник проверки результатов. Первый позволяет многократно ускорить составление методик. Достаточно лишь задать определяемые элементы, и "помощник" сам рассчитает все массовые числа (в том числе оксидных, многозарядных ионов и т.п.), элементы внутреннего стандарта, предложит оптимальную схему калибровки. Помощник проверки результатов автоматически определяет наличие спектральных наложений на основании данных по всем элементам и массовым числам для всех измеренных образцов. Как известно, поиск наложений вручную не только отнимает много времени, но и требует высокой квалификации персонала.
Не последнее место занимает экономичность прибора, а также удобство его обслуживания. Спектрометр ICP-MS 2030 гораздо компактнее большинства других аналогичных приборов, его эксплуатационные расходы сведены к минимуму. Плазменная горелка новой конструкции, разработанная и запатентованная компанией, обеспечивает низкий расход аргона: 10 л/мин в режиме работы и 5 л / мин в режиме ожидания, так называемом экорежиме. Этот режим активируется даже при небольшой паузе между измерениями, а выход из него в рабочий режим происходит моментально. Конструкция горелки обеспечивает стабильность плазмы даже при использовании аргона промышленной чистоты 99,95%, поэтому нет необходимости покупать дорогой высокоочищенный аргон.
Процедуры технического обслуживания весьма просты: многие детали прибора легко извлекаются и устанавливаются самим пользователем без специальных инструментов. Конусы интерфейса между плазменной и вакуумной частью (самплер и скиммер) можно вытащить для чистки, открутив один винт. При этом нет риска случайных прикосновений к горелке или частям, которые можно загрязнить. Горелка, распылитель и подающие газы шланги также легко снимаются. Все шланги обозначены специальной яркой маркировкой.
Спектрометр ICP-MS 2030 может успешно применяться для решения многих практических задач. В фармацевтике токсичные элементы определяются в концентрациях, которые в несколько тысяч раз ниже предельно допустимых по требованиям ICH Q3D. В пищевой промышленности спектрометр может использоваться для анализа не только опасных примесей, но и необходимых питательных элементов. Экологические задачи включают анализ питьевой воды, сточных вод, содержимого водоемов и различных объектов окружающей среды. Спектрометр можно применять в научных исследованиях – определять степень окисления или химическую форму, в которой тот или иной элемент присутствует в пробе. Для таких задач к прибору можно подключать жидкостный хроматограф Shimadzu Prominence Inert и другие необходимые аппараты".
С новым одноквадрупольным газовым хромато-масс-спектрометром GCMS-QP 2020 нас познакомил специалист по продукции компании Shimadzu Кристофер СОВА (Christopher Sowa).
"Газовый хромато-масс-спектрометр GCMS-QP 2020 впервые появился на рынке в конце прошлого года. Его создание было достойным ответом нашей компании на возрастающие требования к чувствительности приборов и скорости анализов. Cледовые, микроскопические количества летучих соединений необходимо определять во многих отраслях: в пищевой и фармацевтической промышленности, экологии, при разработке новых материалов и препаратов.
Главное достоинство масс-спектро-метра – быстрота сканирования. По всему диапазону масс от 1,5 до 1090 а.е.м. максимальная скорость сканирования составляет 20 тыс. а.е.м. в секунду.
Благодаря такому быстродействию можно регистрировать полный ионный ток одновременно с мониторингом целевых ионов (Full scan SIM), эффективно проводить многомерную газовую хроматографию (GC Ч GC-MS) и сверхбыстрые анализы (Fast-GC / MS). Применение функции ASSP (Advanced Scanning Speed Protocol), оптимизирующей напряжение на стержнях квадруполя в ходе сканирования, позволяет избежать потери чувствительности, связанной с повышением скорости.
Заметно усовершенствована конструкция ионного источника. Между филаментными нитями, генерирующими свободные электроны, и камерой ионизации расположены защитные пластины, предотвращающие распространение избыточного теплового излучения и электрического поля. Это повышает стабильность работы и производительность источника. Кроме "традиционного" для газовой хроматографии метода ионизации – электронного удара, можно проводить химическую ионизацию, причем как положительную, так и отрицательную. Важным преимуществом системы является функция Quick-CI – возможность переключения режимов ионизации в ходе сканирования без остановки прибора. Благодаря этому химическая ионизация может быть активирована в любой момент: например, при выходе вещества с колонки какое-либо короткое время проводится химическая ионизация, а затем – снова электронный удар.
Еще одно усовершенствование коснулось системы вакуумирования. В ее основе – высокомощный турбомолекулярный насос, имеющий два канала для независимой откачки камеры ионного источника и квадрупольного масс-фильтра. Также имеется форвакуумный насос. Эффективная работа системы откачки не только повышает чувствительность и производительность анализов, но и дает возможность использовать различные газы в качестве газов-носителей. Кроме гелия, могут успешно применяться водород и азот. Это часто позволяет снизить эксплуатационные расходы.
Программный пакет GCMS Insight многократно повышает эффективность анализа многокомпонентных смесей. Функция Smart SIM автоматически создает метод анализа таким образом, что целевые ионы каждого из определяемых соединений регистрируются только во время его выхода с колонки. Поэтому за один аналитический цикл теперь можно определять сразу много целевых соединений, не проигрывая в чувствительности. Программный модуль LabSolutions Insight обеспечивает представление данных на экране в удобном и интуитивно понятном виде, что значительно облегчает их анализ оператором. Особый модуль программы отвечает за автоматический расчет индексов удерживания, что дает возможность определять нужные соединения без использования дорогостоящих стандартов. Наконец, программный пакет включает целый набор баз данных для определения пестицидов, продуктов метаболизма, пахучих соединений, экотоксикантов, взрывчатых и опасных веществ, наркотиков, и т.п. Даже если в образце есть какое-то неизвестное соединение, например, новый, недавно синтезированный наркотик, чаще всего удается определить не только его химическую формулу, но и отнести его к определенному классу веществ".
Компания LECO – один из мировых лидеров в производстве аналитического оборудования для угольной и горнорудной промышленности, черной и цветной металлургии. История компании ведет отсчет с 1936 года, когда был произведен первый экспресс-анализатор углерода для сталелитейной промышленности США. С конца 1990-х годов компания успешно развивает новое для себя направление – производство времяпролетных хромато-масс-спектрометров. Благодаря реализации новейших технических решений, они быстро приобрели мировую известность. В 2011 году на выставке Pittcon времяпролетный жидкостный хромато-масс-спектрометр LECO Citius LC-HRT был удостоен золотой медали выставки Pittcon (Pittcon Editors’ Gold Award). Штаб-квартира компании расположена в г. Сент-Джозеф (Штат Мичиган, США), там же находятся производственные мощности и опытно-конструкторские центры. Компания имеет свыше 30 представительств в различных странах мира, в том числе в России.
Времяпролетные масс-анализаторы LECO Pegasus зарекомендовали себя как высокопроизводительные системы, которые можно применять как для рутинных анализов, так и для фундаментальных научных исследований. Они позволяют получать масс-спектры высокого разрешения с максимальной скоростью регистрации и точностью измерения масс. Системы двумерной газовой хроматографии обеспечивают исключительное качество разделения сложных многокомпонентных смесей, благодаря сочетанию капиллярных колонок с различной селективностью и термомодуляции с криофокусированием аналитов.
В конце прошлого года на рынке появился газовый хромато-масс-спектрометр Pegasus GC-HRT 4D. Он сочетает в себе преимущества всех прежде существовавших систем LECO на платформе Pegasus. С этим прибором нас познакомил директор Европейского отдела маркетинга компании LECO Игорь БОРИСОВ.
"Цель создания нового прибора Pegasus GC-HRT 4D – возможность максимально полной, исчерпывающей характеристики каждого из образцов. На фоне основных компонентов часто присутствуют скрытые минорные соединения, пики которых сложно заметить на хроматограммах. Высокое разрешение и комплексная математическая обработка результатов позволяет идентифицировать максимальное число компонентов каждого образца и с высокой достоверностью определить их химическую структуру.
Этот прибор – первый в мире, где двумерная газовая хроматография комбинируется с времяпролетным масс-анализатором высокого разрешения, достигаемого за счет зигзагообразной траектории ионов. Такие технологии использовались нами и раньше[2], но никогда прежде не сочетались в одном приборе. Программное обеспечение дополнено особым алгоритмом деконволюции спектров высокого разрешения HRD (High Resolution Deconvolution).
Времяпролетный масс-анализатор обеспечивает разрешение 50 тыс., точность определения масс – 1 ppm. Скорость регистрации – до 200 полных масс-спектров в секунду. Хочу подчеркнуть, что времяпролетные масс-анализаторы как нельзя лучше подходят для анализа большого числа узких хроматографических пиков. В отличие от квадрупольных или сканирующих анализаторов, они определяют все значения m / z одновременно, а не поочередно. Поэтому даже при очень быстрой регистрации спектров не наблюдается типичных искажений, когда, например, масс-спектры одного хроматографического пика на противоположных склонах выглядят по-разному. В кластерах молекулярных и фрагментных ионов наблюдается точное соответствие соотношений интенсивностей изотопных пиков теоретически рассчитанным значениям.
Высоким разрешением масс-анализатор обязан особой конструкции по технологии FFP (folded flight path). Ионы пролетают по зигзагообразной траектории с многократным отражением плоскими бессеточными зеркалами с обратной фокусировкой. За счет этого длина пути пролета увеличивается до 40 м – соответственно, повышается и разрешение, а размеры самого анализатора остаются компактными. Интересно, что идея многоотражательного анализатора с бессеточными зеркалами появилась еще в СССР, затем была доработана научной группой А.Н.Веренчикова, после чего приобретена компанией LECO и запатентована.
Конструкция ионного источника адаптирована для работы в режиме двумерной газовой хроматографии, то есть для регистрации узких хроматографических пиков с шириной менее 0,1 с. Возможна работа в режиме электронной или химической ионизации. При электронной ионизации можно использовать в качестве газа-носителя как гелий, так и водород. Если электронная ионизация обеспечивает эффективную фрагментацию ионов, то химическая ионизация, будучи более мягким методом, позволяет получать интенсивные псевдомолекулярные ионы. В целом, получаемой масс-спектральной информации бывает достаточно, чтобы с высокой степенью достоверности определять химическое строение компонентов и состав анализируемых смесей.
Для реализации двумерной газовой хроматографии использован четырехструйный термический модулятор, который не расходует ни жидкий азот, ни другие хладагенты – используется внешний охлаждающий блок. Внутри основного термостата хроматографа находится второй термостат, работающий независимо – он отвечает за температурный режим второго хроматографического измерения. Время модуляции можно изменять в зависимости от аналитической задачи и варьировать его в ходе одного эксперимента для оптимального разделения компонентов с разными свойствами.
Единое программное обеспечение LECO ChromaTOF обеспечивает управление всеми модулями системы, запись и обработку результатов анализа. Алгоритм HRD (High Resolution Deconvolution) заключается в выделении чистых масс-спектров по совпадающим максимумам в индивидуаль-ных масс-хроматограммах во всем диапазоне масс. Этот алгоритм максимально эффективно использует возможности современной математики, позволяя находить отдельные компоненты очень сложных смесей. Как говорят разработчики, "система Pegasus GC-HRT 4D одержала полную победу над проблемой одновременного элюирования".
Определение химического строения неизвестных веществ проводится на основе целого комплекса получаемых данных. Это анализ хроматографических данных и значений точных масс, подбор брутто-формул с помощью молекулярного калькулятора точных масс, графическая систематизация дефектов масс, сравнение относительных интенсивностей изотопных пиков с теоретическими значениями для заданных элементных составов, сравнение с библиотечными масс-спектрами в номинальных значениях масс и онлайн-базами структурных формул новых химических веществ. Такая исчерпывающая информация позволяет надежно идентифицировать детектируемые соединения.
Система Pegasus GC-HRT 4D открывает новые аналитические возможности для любых областей, где широко применяется метод хромато-масс-спектрометрии. В первую очередь, это нефтехимия, криминалистика, экология и метаболомика – те области, где требуется анализ сложных многокомпонентных образцов. Возможность проведения обзорного анализа сложных объектов неизвестного состава и достоверной идентификации определяемых компонентов является существенным преимуществом данного метода. Мы надеемся, что новая система будет чрезвычайно полезна российским клиентам и обеспечит новый уровень решения многих аналитических и исследовательских задач".
Компания Waters – крупная мировая корпорация, разрабатывающая и производящая лабораторное аналитическое оборудование и программное обеспечение, необходимое для его работы. Основанная в 1958 году в Массачусетсе, компания сейчас имеет около десятка заводов-производителей и более 30 представительств по всему миру. Особую известность корпорация Waters приобрела в 2004 году, разработав и внедрив технологию UPLC (Ultra Performance Liquid Chromatography). Она позволила значительно повысить производительность жидкостной хроматографии за счет уменьшения размеров сорбента до 2 мкм и менее. На сегодняшний день корпорация производит множество разнообразных жидкостных хроматографов и хромато-масс-спектрометров, включая известную широкому кругу специалистов систему ACQUITY UPLC, систему сверхкритической жидкостной хроматографии ACQUITY UPC2, гибридные HPLC-UPLC хроматографы, позволяющие использовать сертифицированные методы HPLC в режиме UPLC, и многое другое.
В прошлом году компанией был разработан и представлен квадрупольный времяпролетный масс-спектрометр Vion IMS QTof, разделяющий ионы не только по массовым числам, но и по ионной подвижности. Это первый прибор такого класса, предназначенный для рутинных анализов. Также на выставке analytica 2016 экспонировался компактный масс-спектрометр с тройным квадруполем Xevo TQ-S micro, обладающий высокой чувствительностью и производительностью. Об этих инструментах нам рассказала директор по стратегическому маркетингу компании Waters по странам Европы и Индии д-р Цзин ЛИН (Jing Lin).
"Масс-спектрометр Xevo TQ-S micro впервые появился на рынке около двух лет назад. Он обладает компактными размерами, демонстрируя при этом исключительно высокие аналитические характеристики. Такое стало возможным, благодаря комбинации нескольких оригинальных технологий, разработанных и запатентованных компанией Waters. Масс-спектрометр сочетается с любыми ионными источниками Waters: ESI, APCI, APPI, ESCi, IonKey/MS, nanoFlow ESI, APGC, ASAP. Его можно использовать совместно с новейшими хроматографическими системами Waters Acquity UPLC-H, UPLC-I, UPLC-M и UPC2, а также с хроматографами некоторых других производителей.
Технология T-wave (travelling wave), примененная в ячейке соударений Xevo TQ-S, значительно повышает скорость работы в режиме MRM (Multiple reaction monitoring) без ущерба для качества результатов. Можно регистрировать до 500 MRM-переходов в секунду. Конструкция ячейки включает набор электродов в виде параллельно расположенных тонких колец, к которым прикладывается постоянный ток и осциллирующее радиочастотное поле. С помощью определенной комбинации потенциалов на соседних кольцах можно создать барьер, тормозящий ионы, а путем перемещения этого барьера вдоль ячейки контролируется скорость ионного потока. Если создать несколько барьеров, перемещая их друг за другом, то фрагментируемые ионы будут двигаться группами, волнами. Это гораздо эффективнее, чем непрерывный ионный поток, в котором могут возникать взаимные помехи и диффузия. В нашем случае взаимное влияние соседних MRM-каналов друг на друга не более 0,001%.
Скорость сканирования масс достигает 20 000 а.е.м./с. Это позволяет регистрировать полный ионный ток и MRM-переходы одновременно (так называемый режим RADAR). Регистрация полного тока дополняет классические методы тандемного анализа, основанные на наблюдении MRM-переходов. Она дает возможность обнаруживать не только целевые, но и другие соединения, которые могут тоже представлять интерес. Полный ионный ток дает информацию о точном составе матрицы, который может меняться от образца к образцу. При необходимости можно регистрировать одновременно положительные и отрицательные ионы (переключение полярности занимает всего 15 мс), быстро менять тип ионизации (если установлен ионный источник ESCi).
Детектор, сконструированный по технологии XDR (eXtended Dynamic Range), обеспечивает динамический диапазон в шесть порядков величины, начиная от предела обнаружения определяемого соединения. Не нужно проводить повторные анализы, разбавляя или концентрируя образцы.
При испытании больших серий образцов чувствительность масс-спектрометра может ухудшиться из-за загрязнения его узлов. Особенно остро стоит такая проблема для высокопроизводительных лабораторий, где сотнями и тысячами исследуют образцы, находящиеся в сложных матрицах – это могут быть, например, белки плазмы крови. Спектрометр Xevo TQ-S micro сохраняет чувствительность даже после многих тысяч анализов, благодаря особой геометрии ионного источника и системы линз между источником и анализатором. Сам источник выполнен по технологии ZSpray. Образующиеся ионы направляются в улавливающий конус по искривленной траектории, а компоненты матрицы и нейтральные частицы пассивно движутся прямо и удаляются. Система ионных линз выполнена по аналогичной технологии StepWave: в определенной точке происходит фокусировка ионного потока и искривление его траектории, а нейтральные частицы летят прямо. Сама по себе технология StepWave дает 25-кратный выигрыш в чувствительности анализов.
Наконец, нужно отметить преимущества программного обеспечения. Функция IntelliStart упрощает процедуру запуска анализов и уменьшает количество сложных операций. Серии анализов может запускать даже неопытный человек. Модуль QCMonitor проверяет все рабочие параметры перед запуском и во время анализа. Если хотя бы один из них выходит за границы нормы, анализ будет тут же остановлен, а оператор получит оповещение по электронной почте. База данных QUANPEDIA содержит самые разнообразные аналитические процедуры, основанные на составлении четких графиков регистрации MRM-переходов. Модуль TargetLynx помогает точно рассчитывать концентрации определяемых соединений в сложных образцах с непостоянным составом матрицы. Если для этого необходимы какие-либо внутренние стандарты, программа информирует оператора.
Квадрупольный времяпролетный масс-спектрометр Vion IMS QTof разделяет ионы сразу двумя способами – по массовым числам и ионной подвижности. Раньше подобные приборы предназначались только для научных исследований, поскольку они были крупногабаритными, сложными в эксплуатации и обслуживании. С появлением Vion IMS QTof такое "двойное" разделение стало доступно широкому кругу лабораторий, в том числе проводящим рутинные анализы.
Кто из химиков-аналитиков не сталкивался с проблемой изомеров, неразличимых даже на самом высокоточном масс-спектрометре? Бывает, что они не разделяются также и на хроматографической колонке – тогда приходится придумывать и тестировать десятки изощренных методик. Также актуальна проблема наложения пиков, которая тем серьезнее, чем сложнее состав образца, чем больше в нем компонентов. Из-за наложения пиков важные соединения могут оставаться незамеченными. Пики интересующих соединений могут быть скрыты пиками матрицы, концентрация которой на несколько порядков выше. Наконец, время хроматографического удерживания может меняться от образца к образцу, в частности, из-за непостоянного состава матрицы. Поэтому совпадение или различие времени удерживания не может служить абсолютно надежным критерием идентификации.
Все эти проблемы были решены благодаря введению еще одного разделяющего параметра, независимого от массового числа и времени удерживания. Это ионная подвижность, то есть способность молекулярных ионов дрейфовать под действием электрического поля в противотоке дрейфового газа (гелия). Скорость дрейфа определяется прежде всего пространственной структурой и конформацией молекул. Компактные ионы сталкиваются с атомами гелия меньше раз, чем крупные, размашистые. Количественной характеристикой ионной подвижности является сечение столкновения (collision cross-section, CCS), измеряемое в квадратных ангстремах (Е2). Оно соответствует эффективной площади взаимодействия молекулярного иона с атомами дрейфового газа. Структурные изомеры вещества имеют, как правило, разные значения CCS. Современное программное обеспечение позволяет с высокой точностью предсказывать эти значения.
Спектрометр Vion IMS QTof, как и предыдущий прибор, совместим с целым рядом различных ионных источников, которые пользователь может самостоятельно заменять. Образующиеся ионы попадают в систему линз StepWave, где происходит очистка ионного пучка от нейтральных частиц и его фокусировка. Далее расположена дрейфовая ячейка, выполненная по описанной выше технологии T-Wave. Значение CCS регистрируется здесь для каждого пролетающего иона. После дрейфовой ячейки находится еще одна фокусирующая система ионных линз. Затем идет, собственно, масс-спектрометрическая часть: квадрупольный фильтр, ячейка соударений XS Collision Cell, времяпролетный анализатор и детектор. Ячейка соударений имеет мультисегментную структуру, благодаря которой проанализированные ионы можно очень быстро выводить наружу, ускоряя начало регистрации следующего MRM-перехода. На выходе из ячейки расположена специальная система фокусирующей ионной оптики. Времяпролетный анализатор выполнен по технологии QuanTof2 с расширенным динамическим диапазоном. В целом, конструкция масс-спектрометрической части прибора обеспечивает высокие аналитические характеристики: разрешение составляет 50 тыс., а погрешность определения массы – менее 1 миллионной доли.
Спектрометр Vion IMS-QTof управляется научно-информационной системой UNIFI. Это единая программная платформа, позволяющая получать, идентифицировать и обрабатывать результаты. Система UNIFI позволяет проводить эксперимент в режиме HDMSE-Unlimited Product Ion: в квадрупольный фильтр и в ячейку соударений попадают не все ионы одновременно, а будучи уже разделенными в соответствии с ионной подвижностью. Поэтому по результатам можно сразу определить, какой родительский ион соответствует тому или иному иону-предшественнику и наоборот. Без использования этого режима подтверждение связи между фрагментом и предшественником требует дополнительных экспериментов тандемной масс-спектрометрии. Даже при анализе неизвестных соединений, когда отсутствуют сведения о времени удерживания, массе и значении CCS, система UNIFI позволяет теоретически рассчитать эти значения, а затем сравнить их с полученными в ходе анализа.
Помимо собственно масс-спектрометров, компания Waters представила на выставке analytica 2016 также компактный масс-спектрометрический детектор для хроматографических систем Acquity Qda и необычный ионный источник IonKey / MS, в котором капиллярная хроматографическая колонка и интерфейс ионизации находятся в миниатюрном сменном устройстве[3]. Одноквадрупольный детектор Acquity QDa служит прекрасным дополнением к оптическим и флуоресцентным детекторам хроматографических систем – он полностью совместим с другими видами детектирования. Дополнительная информация о массовых числах бывает весьма полезна хроматографистам – она дает возможность обнаруживать и разделять соединения без использования стандартов. Ионный источник IonKey / MS разработан для жидкостной хроматографии микро- и наномасштабов, где используются капиллярные колонки. Она полностью решает проблему неплотного контакта между колонкой и интерфейсом ионизации – они перманентно соединены друг с другом в сменной кассете iKey, которая вставляется в ионный источник, как ключ в замок. За последние два года выбор хроматографических сорбентов и диапазон размеров капилляров, используемых во вставках iKey, был значительно расширен".
Корпорация Bruker принадлежит к числу ведущих мировых производителей аналитического оборудования. Начав в 1960 году с производства ЯМР-спектрометров, компания за более чем полвека включила в
направления своей деятельности практически все основные виды приборов, востребованные в академических и заводских лабораториях. Сегодня Bruker предлагает передовые решения в широком спектре областей: от ИК-, БИК-фурье-, КР-спектроскопии до магнитного резонанса, от рентгеновской дифракции, элементного анализа до систем масс-спектрометрии высокого и сверхвысокого разрешения. При этом в каждой новой разработке во главу угла ставится достижение максимальной эффективности и пользовательского удобства.
На выставке analytica 2016 корпорация Bruker представила сразу несколько новых масс-спектрометрических решений – rapifleX MALDI TissueTyper для высокопроизводительного скрининга биомаркеров различной природы в биологических тканях, а также PesticideScreener и ToxScreener 2.1 на базе тандемных квадруполь-времяпролетных масс-спектрометров, упрощающие выявление токсикантов, наркотических соединений и пестицидов в пищевом сырье, продуктах и биологических жидкостях. Об этих и других последних разработках компании рассказывает директор службы маркетинговых коммуникаций корпорации Bruker д-р Торстен ТИЛ (Thorsten Thiel).
"Масс-спектрометрическое направление корпорация Bruker развивает с 1980 года. Сегодня наша продукция включает несколько линеек оборудования на основе времяпролетных, квадруполь-времяпролетных масс-спектрометров, систем с ионной ловушкой или тройным квадруполем, а также масс-спектрометров ионно-циклотронного резонанса с преобразованием Фурье. Каждую свою новую разработку мы стараемся выполнить "под ключ", так, чтобы она максимально полно отвечала решаемой с ее помощью задаче.
Основные проблемы в работе с объектами исследований, которые принадлежат сфере наук о жизни, состоят в их многокомпонентном составе, сложности химической структуры, высокой молекулярной массе и низкой химической устойчивости. Поэтому MALDI-TOF масс-спектрометры, сочетающие в себе мягкость ионизации, высокую разрешающую способность и широкий диапазон масс крайне востребованы в сфере наук о жизни. Компания Bruker Daltonics разработала целую серию масс-спектрометров FLEX и вспомогательных систем, которые позволяют успешно решать целый ряд актуальных задач, таких как анализ белков/пептидов и биополимеров, молекулярная визуализация в тканях (MALDI Imaging, специализированное решение – rapifleX MALDI Tissuetyper), анализ гликанов и идентификация микроорганизмов (MALDI Biotyper, специализированное решение в настольном исполнении – microflex LT).
Серьезную проблему при анализе образцов биологического происхождения представляет высокопроизводительный скрининг на наличие биологической активности в большом числе проб. Чтобы упростить и облегчить эту работу, в Bruker Daltonics разработано новое решение MALDI PharmaPulse, позволяющее без введения меток работать с большинством биологических мишеней. В его основе, с одной стороны, лежат аналитические возможности тандемного времяпролетного масс-спектрометра, позволяющие с высокой чувствительностью и селективностью безмаркерно идентифицировать вещества в сложных смесях и с молекулярным весом до 8 тыс. а.е.м. Это позволяет успешно работать даже с такими трудными объектами исследования, как гликопептиды и пептиды, содержащие несколько сульфидных групп. С другой стороны, используемая в данном масс-спектрометре система smartbeam 3D laser позволяет проводить анализы с частотой импульсов 10 кГц и с высокоточным позиционированием на мишени с помощью движущегося зеркала. В MALDI PharmaPulse все эти технологические возможности объединены для создания полностью автоматизированной системы ввода большого количества образцов для проведения скрининга со сверхвысокой пропускной способностью.
Пробы объемом от 1 мкл в стандартных 96-, 384- и 1536-луночных планшетах для титрования помещаются на специально разработанный легковесный адаптор на поддоне из нержавеющей стали и автоматически поступают в масс-спектрометр. Анализ одного образца занимает от 0,5 до 1 с, то есть меньше 25 мин на 1536-луночный планшет. Обработка данных масс-спектров производится с помощью разработанного в компании Bruker программного пакета Compass, интуитивно понятного в использовании и позволяющего переносить полученные результаты в другие программные среды для дальнейшей работы или визуализации.
Разработанная система MALDI PharmaPulse совместима с комплексом полной автоматизации компании HighRes Biosolutions, включающим карусельный штатив на 172 планшета и высокоточный робот-манипулятор ACell. Программное обеспечение HighRes Biosolutions Cellario интегрирует все устройства в единую систему, действующую по заданному оператором сценарию. Дополнительно увеличить производительность MALDI PharmaPulse позволяет система пробоподготовки mosquito производства компании TTP Labtech. Она с высокой скоростью (<1 c на образец) и субмикролитровой точностью обеспечивает смешение образцов с матрицей, необходимой в методе МАЛДИ. В целом полностью автоматизированный комплекс позволяет анализировать более 100 тыс. проб в день.
Решение MALDI PharmaPulse адресовано в первую очередь лабораториям, работающим в области фармацевтики, биотехнологии и занимающимся высокопроизводительным скринингом. Оно предназначено ускорить поиск и разработку новых высокоэффективных препаратов.
В области анализа пищевых продуктов, объектов окружающей среды и биологических проб компания Bruker представила два новых решения PesticideScreener 2.1 и ToxScreener 2.1. Они основаны на сочетании возможностей тандемных квадруполь-времяпролетных масс-спектрометров Bruker и обновленной версии программного комплекса TASQ 1.1 (TASQ – Target Analysis for Screening and Quantitation).
PesticideScreener 2.1 и ToxScreener 2.1 основаны на хроматографическом разделении методом СВЭЖХ и последующем масс-спектрометрическом детектировании, где с высоким разрешением определяются точные массы ионов и их фрагментов, полученных в режиме диссоциации, индуцированной соударениями. Найденные значения времени удерживания, точных масс молекулярных и фрагментных ионов, а также информация об изотопных пиках соотносятся с базой данных, включающей более 2 тыс. соединений – пестицидов, токсичных и наркотических веществ. Использование ПО TASQ 1.1 исключает появление ложно-положительных результатов и позволяет в дальнейшем расширять БД в соответствии с потребностями пользователя. Время полного анализа составляет менее 20 мин.
В состав предлагаемых компанией Bruker наборов PesticideScreener 2.1 и ToxScreener 2.1 входят предколонки и аналитические колонки, соответствующие разделяемым классам веществ, точные рекомендации по условиям разделения и масс-спектрометрического анализа. Кроме того, комплект также обязательно содержит наборы тестовых веществ и базу данных с указанием точных масс молекулярных ионов, аддуктов, осколочных ионов, а также времени удерживания в условиях градиентного элюирования. Новые решения призваны увеличить производительность и надежность скрининга образцов на наличие вредных и опасных веществ в пищевых и экологических лабораториях, а также в судебно-медицинской экспертизе".
Более 40 лет компания SCIEX специализируется на выпуске передового оборудования в области ВЭЖХ, масс-спектрометрии и капиллярного электрофореза. Эти инструменты хорошо известны и востребованы среди специалистов как в области академических исследований, так и в прикладном применении, например, для создания новых лекарственных средств, в клинических исследованиях, судебно-медицинских экспертизах, анализе продуктов питания и объектов окружающей среды. Все свои разработки компания поддерживает подробными и всесторонними методическими рекомендациями, упрощающими пользователям освоение новой техники применительно к их текущим аналитическим задачам.
Компания SCIEX развивает несколько линеек гибридных хромато-масс-спектрометрических систем, использующих квадруполь-времяпролетные масс-анализаторы и гибридные трех-квадрупольные анализаторы с линейной ионной ловушкой. На выставке analytica 2016 демонстрировался новый квадруполь-времяпролетный масс-спектрометр высокого разрешения Х-серии – X500R QTOF, предназначенный для рутинных анализов. О нем рассказывает старший специалист по методической поддержке в области анализа продуктов питания и окружающей среды д-р Джасмин МЕЛТРЕТТЕР (Jasmin Meltretter).
"С выпуском X500R QTOF в конце 2015 года компания SCIEX начала новую Х-серию квадруполь-времяпролетных хромато-масс-спектрометров. Каждая модель новой серии станет оптимизированным инструментальным и программным решением для конкретных целевых задач. Создавая первую модель этой серии, мы ориентировали его на проведение экспертиз в пищевых, экологических и судебно-медицинских лабораториях. X500R QTOF – идеальный инструмент для решения этого класса аналитических задач. В приборе органично сочетаются высокая производительность и разрешающая способность, простой и удобный интерфейс, надежность работы и мощное, но "дружественное" программное обеспечение.
В масс-спектрометре X500R QTOF используется защищенный патентом двухзондовый источник ионов Turbo V, сопряженный с системами жидкостной хроматографии. В зависимости от решаемых задач можно выбрать метод ионизации – электрораспылительную (ESI) с помощью зонда TurboIonSpray или химическую с помощью зонда APCI.
Зонд TurboIonSpray позволяет работать с диапазоном потоков 5–3 000 мкл / мин и обеспечивает достаточно щадящие условия ионизации для того, чтобы исследовать термолабильные соединения, такие как, например, пептиды, белки, олигонуклеотиды и лекарственные препараты, чувствительные к температуре. Образцы, поступающие в зонд, сначала ионизируются под действием высокого напряжения (IonSpray), а затем распыляются струей горячего сухого сверхчистого газообразного азота из турбонагревателя, образуя туман из небольших капелек с большим зарядом. При этом могут генерироваться многозарядные ионы, ценные при исследовании биополимеров.
Источник химической ионизации, зонд APCI, рассчитан на поток элюата 50–3 000 мкл / мин. Он хорошо подходит для работы со сложными и загрязненными образцами, а также с низкополярными веществами, которые не сразу образуют ионы в растворе. Зонд APCI обеспечивает быструю десольватацию и испарение капелек с исследуемыми веществами, гарантируя их минимальное температурное разложение и сохранение молекулярной структуры при ионизации с помощью иглы коронного разряда. Это позволяет работать с полностью водными растворами, в том числе буферными, которые обрабатываются источником ионов без существенного загрязнения инструмента.
Полученный ионный пучок далее фокусируется с помощью квадрупольного ионопровода Qjet и поступает последовательно в квадрупольные масс-фильтр Q1 и камеру ионизации соударениями (CID). Дальнейший анализ происходит в области времяпролетного масс-анализатора, включающего оптимизированную систему ионных линз с каналом 4 мм (N-оптику) и систему стабилизации температуры для увеличения надежности и повышения точности измерений масс. Встроенная система автокалибровки по массе позволяет масс-спектрометру работать длительное время, не прерываясь и не приостанавливая поточного анализа образцов.
Управление X500R QTOF и обработка полученных данных проводится с помощью операционной системы SCIEX OS, полностью переработанной для использования в масс-спектрометрах Х-серии. Она отличается простотой пользовательского интерфейса, легкостью получения, анализа и представления данных, наглядностью выводимых отчетов. Режим накопления значений при интерпретации тандемных спектров расширен высокоразрешающими методами SWATH, MRMHR, информационно зависимого (IDA) и высокоскоростного сканирования. Сочетание инструментальных и программных возможностей позволяет масс-спектрометру поддерживать разрешение не ниже 30 тыс. (по ширине пика на полувысоте). Этого оказывается достаточным, чтобы при наличии постоянно расширяемых баз данных (БД) масс ионов и их фрагментов надежно идентифицировать анализируемые вещества. Стандартная комплектация прибора включает БД пестицидов, антибиотиков, микотоксинов, лекарственных и наркотических средств, содержащихся в воде, продуктах питания, напитках, биологических жидкостях.
Масс-спектрометр X500R QTOF полностью соответствует требованиям к прибору для проведения рутинных количественных и качественных анализов. Высокое качество и точность проводимых измерений сочетаются с удобством эксплуатации и легкостью обучения оператора. Система имеет компактный настольный дизайн с габаритными размерами 110 Ч 57 Ч 112 см. Ее внутренние блоки и устройства, требующие регулярного обслуживания, такие как Turbo V и Qjet, легко доступны и снимаются. В случае необходимости пользователи X500R QTOF всегда могут получить дополнительную техническую и методическую поддержку у специалистов компании SCIEX, в том числе и по сети Интернет".
[1] Подробнее см.: Гордеев К., Шахнович И. Аналитическая спектрометрия сегодня: от новых технологий к новым открытиям // Аналитика. 2016. № 1. С. 36–61.
[2] См.: Шахнович И. Платформа LECO Pegasus – сочетание газовой хроматографии и времяпролетной масс-спектрометрии // Аналитика. 2015. № 1. С. 12–24.
[3] Подробнее см.: Аналитика. 2014. № 5. С. 43–45.
что такое масс-спектрометрия, или как взвесить молекулу — T&P
Что происходит с образцами крови, которую вы сдаете на клинический анализ? Сколько весит ваш гемоглобин? Каким образом ученые вообще взвешивают молекулы — мельчайшие частицы вещества, которые невозможно увидеть или потрогать? Обо всем этом в рамках рубрики «Просто о сложном» T&P рассказала студентка 5-го курса кафедры химической физики ФМХФ, сотрудница лаборатории ионной и молекулярной физики МФТИ Екатерина Жданова.
Екатерина Жданова
Очень часто методы исследований интересуют лишь специалистов в конкретных областях и остаются в тени более фундаментальных проблем, например происхождения жизни или принципов работы человеческого сознания. Тем не менее для поиска ответа на «главный вопрос жизни, Вселенной и всего остального» сначала необходимо научиться отвечать на вопросы более простые. Например, как взвесить молекулу? Обычные весы тут вряд ли помогут: масса молекулы метана — около 10^(-23) грамм. Молекула гемоглобина, крупного и сложного белка, весит в несколько раз больше — 10^(-20) грамм. Ясно, что необходим какой-то иной подход к проблеме, ведь привычные нам измерительные приборы к ней не применимы. Надо также понимать, что, взвешивая в магазине яблоки или становясь на весы после тренировок, мы на самом деле измеряем силу, действующую на прибор — весы. Затем уже происходит пересчет в привычные нам единицы — граммы и килограммы.
Но как же взвесить молекулу? Здесь природа оставила нам лазейку. Оказывается, заряженные частицы «чувствуют» присутствие электрического и магнитного поля и изменяют траекторию и характер своего движения. На заряженные частицы также действуют силы, величину которых можно пересчитать в отношении массы к заряду. Этот метод сегодня довольно популярен и называется масс-спектрометрия. Первооткрывателем масс-спектрометрии считается сэр Дж. Дж. Томсон, нобелевский лауреат по физике. Он обратил внимание на то, что заряженные частицы движутся в магнитном поле по параболическим траекториям, пропорциональным отношению их массы к заряду.
Схема работы масс-спектрометра состоит из нескольких этапов. Прежде всего анализируемое вещество должно пройти ионизацию. Затем оно попадает в систему ионного транспорта, которая должна доставить заряженные частицы в масс-анализатор. В масс-анализаторе как раз происходит разделение ионов в зависимости от отношения массы к заряду. В завершение ионы попадают на детектор, данные с которого анализируются с помощью специального программного обеспечения. Полученная таким образом картинка представляет собой спектр, то есть распределение частиц. Одна из осей этого графика — отношения массы к заряду, вторая — интенсивность. Каждый из пиков на таком графике будет характерным для ионов конкретного вещества, поэтому попадание в прибор посторонних веществ, например воздуха, может привести к искажениям результатов. Чтобы избежать этого, применяется вакуумная система.
Time-of-flight secondary-ion mass spectrometry
Сравнительно простая физическая концепция данного метода требует ряда нетривиальных инженерных решений. Как ионизировать молекулы? Каким способом создавать электромагнитное поле? Атомы и молекулы электрически нейтральны, поэтому для проведения масс-спектрометрических измерений необходимо их ионизировать, то есть оторвать электроны с внешних атомных орбиталей или добавить протон. Важную роль играет тип образца, с которым предстоит работать. Для исследования неорганических веществ — металлов, сплавов, горных пород — необходимо использовать одни методы, для органических веществ подходят другие. Очень многие органические вещества (такие как ДНК или полимеры) сложно испарить, то есть перевести в газ, без разложения, а это значит, что исследования живой ткани или биологических образцов требуют применения специальных методов. Кроме того, при ионизации молекулы могут распадаться на отдельные фрагменты. Так мы снова встаем перед вопросом: что именно мы собираемся измерить? Массу всей молекулы или массу фрагментов? И то и другое важно. Более того, измерив массу целой молекулы, исследователи часто специально дробят ее на куски. Так, определив массу структурных элементов белка, мы вместе с тем определяем и их количество, что позволяет нам делать выводы о его химическом составе и структуре.
Все это говорит о разнообразии существующих масс-спектрометров, каждый из которых применяется для решения задач в конкретной области. Этот метод практически незаменим в тех случаях, когда ученым необходимо определить химический состав вещества. Фармацевты применяют масс-спектрометрические эксперименты при разработке лекарств, исследованиях фармакокинетики (то есть биохимических процессов, происходящих в организме при принятии лекарства) и метаболизма. Ученые-биологи используют масс-спектрометрию для анализа белков, пептидов и нуклеиновых кислот. Кроме того, если мы хотим проверить качество воды или продуктов питания, то нам снова не обойтись без этого метода.
Отдельная инновационная область применения масс-спектрометрии — медицинская диагностика. К развитию множества заболеваний приводят структурные изменения белков нашего организма: обычно они классифицируются по образованию характерного кусочка, пептида-маркера. Если вовремя определить такую мутацию, то появляется возможность лечить болезнь на ранней стадии. Кроме того, благодаря современным масс-спектрометрам становится возможным проводить исследования такого рода в режиме реального времени — например, в ходе нейрохирургической операции. Это позволяет точно определять границы между здоровой тканью и опухолью, что критически важно для хирургов.
Кажущаяся на первый взгляд сухой и узкопрофильной, масс-спектрометрия при внимательном ознакомлении оказывается удивительно богатой областью, объединяющей широкий класс приложений с необычными инженерными решениями. Наука показывает, что ответы на менее фундаментальные вопросы порой не менее интересны.
Масс-спектрометрия как базовый инструмент клинической протеомики в диагностике рака - Статьи
Завершив проект генома человека, ученые смогли секвенировать все гены, обнаруженные в ДНК. Цель этого исследования состояла в том, чтобы понять функционирование человеческого тела. Понимание генома позволило получить знания о белках, кодируемых ДНК, но механизмы действия клеток, органов и организма в целом еще не выяснены.Подсчитано, что в геноме человека хранится около 35 000 генов, кодирующих 200–300 000 белков. Раскрыты структура и функции небольшой части этих белков.
Существует множество исследований свойств всех белков, обнаруженных в организме человека. Этот полный набор белков в организме называется протеомом (белковым дополнением генома), который представляет собой белковый компонент, кодируемый геномом. Дисциплина, изучающая протеом, представляет собой быстро развивающуюся область науки, известную как протеомика.Понятие протеомики, т.е. протеомного анализа, было введено в середине 1990-х годов. Цель протеомики состоит в том, чтобы идентифицировать и понять структуру, функции и взаимодействия, которые закодированы в геноме белков, составляющих протеом. Важно, что все клетки организма имеют общий геном, но разные фракции экспрессируются в разных типах клеток и тканей. Протеомные исследования сосредоточены на двух областях исследований. Первый связан с экспрессией белков, а второй связан с их взаимодействием.Целью экспрессионной протеомики является понимание паттернов экспрессии белков при определенных условиях, а также стремление соответствующим образом картировать весь протеом. Использование такой карты было бы важно в токсикологических исследованиях, разработке лекарств и идентификации биомаркеров. Биомаркеры — это белки, уровень экспрессии которых позволяет получить информацию о возникновении конкретных заболеваний или эффективности лекарств. Одной из основных задач клинической протеомики является анализ белковых профилей здоровых и больных людей с целью выявления различий между ними.Ученые в проведенных исследованиях по поиску всего протеома больного человека замечают отклонения. Они включают экспрессию белка, отличную от физиологической. Эти белки становятся биомаркерами конкретного патологического состояния. Выбор метода, используемого в протеомике, определяется многими параметрами белков, например уровнем их экспрессии и модификации, их расположением внутри клеток, сложностью их смесей. Разбивку протеомных технологий можно разделить на методы, используемые для характеристики белков и создания белковых карт, а также те, которые изучают функции и взаимодействия белков.К первой группе протеомных инструментов относятся двумерный электрофорез, масс-спектрометрия и методы, позволяющие идентифицировать белок, такие как «белковый отпечаток пальца». В исследованиях взаимодействия в первую очередь используются иммуноаффинные методы, а также дрожжевая двухгибридная система. Современная протеомика состоит из фундаментальных и клинических исследований. Между этими дисциплинами происходит непрерывный обмен информацией, так называемый перевод, который существенно влияет на непрерывный прогресс знаний о том или ином заболевании [1].
Значение масс-спектрометрии в протеоми клиническая цена
В протеомных исследованиях сочетаются биохимические, физико-химические и биоинформатические методы. В этом исследовании можно одновременно анализировать тысячи белков из определенного типа клеток или тканей. До 1970-х годов массу белка определяли с помощью таких методов, как электрофорез, ультрацентрифугирование или хроматография. Однако эти методы были неточными, погрешность составляла 10-100%.Только внедрение метода масс-спектрометрии МС в 90-х годах способствовало быстрому прогрессу в этой области благодаря внедрению новых методов ионизации. MS определенно конкурирует с другими методами, обычно используемыми в протеомике, в основном из-за возможности анализировать белки в очень низких концентрациях, а также в сложных смесях. Масс-спектрометрия - это аналитический метод, который позволяет точно измерить отношение массы к электрическому заряду иона, где, при известном заряде иона, он позволяет рассчитать массу с точностью до отдельных атомов.Типичный масс-спектрометр состоит из ионизационной камеры, анализатора, который различает ионы по отношению их массы к заряду, и детектора, который подсчитывает количество ионов, подключенных к компьютерной системе регистрации и анализа данных (рис. 1). 2].
Масс-спектрометрия применялась для исследования строения молекул, химического состава, чистоты данного вещества и идентификации примесей. Основными преимуществами масс-спектрометрии являются точность измерения массы, разрешение до нескольких атомных единиц массы и широкий спектр применения, от пептидов до крупных белков (> 200 кДа).Кроме того, МС позволяет обнаруживать структурные варианты белков (посттрансляционно модифицированные белки, мутанты). Важность масс-спектрометрии заключается в разделении в электромагнитном поле за счет величины отношения массы m к заряду (m/z) ионизированных частиц в анализаторе под высоким вакуумом. В зависимости от природы анализируемых веществ применяют различные методы ионизации и разделения ионов. В МС для анализа белков используют анализаторы низкого разрешения (квадрупольные, ионные ловушки) или анализаторы высокого разрешения (измерение времени пролета ионов, ядерный циклотронный резонанс с преобразованием Фурье).Наиболее распространенными методами ионизации являются матрично-активированная лазерно-десорбционная ионизация (MALDI), лазерная десорбция и электрораспыление (ESI) [3].
Методика ESI заключается в распылении жидкости, содержащей испытуемое вещество, в электрическом поле высокого напряжения (примерно 1-5 кВ). В целом этот метод не фрагментирует исследуемые молекулы. При использовании этого метода возбуждения образующиеся ионы часто имеют кратный заряд, при этом количество присоединенных протонов зависит от количества основных аминокислот, присутствующих в исследуемых молекулах.Молекула белка обладает способностью присоединять десяток и даже несколько десятков протонов, поэтому возможен анализ белков с высокой молекулярной массой, которая может составлять несколько сотен тысяч дальтон (Да). Основными преимуществами этого метода являются: высокая чувствительность определений, возможность анализа крупных молекул примерно до 80 000 Да, минимальная фрагментация образца при ионизации, а также совместимость с хроматографическими и электрофоретическими методами. Благодаря совмещению ESI, а позже и MALDI с жидкостной хроматографией, было получено дальнейшее повышение чувствительности анализов в MS [3].
Другим методом ионизации, используемым в спектрометрах для анализа пептидов и белков, является лазерная десорбция в твердой матрице - MALDI.В этом методе используется ионизация лазерным лучом с соответствующим образом подобранной энергией, чтобы не фрагментировать молекулы, а только "выбить их" из правильно подготовленной матрицы. Матрица поглощает энергию лазера, которая, в свою очередь, передается анализируемым молекулам. Спектрометры MALDI используются для анализа белков с массой от ~ 1000 Да до даже нескольких сотен тысяч Да.Метод МАЛДИ заключается в сокристаллизации частиц исследуемого вещества с частицами светопоглощающей матрицы, обычно ароматическими кислотами. Как правило, в качестве матриц используются производные коричной кислоты (например, синапиновая кислота, α-циано-4-гидроксикоричная кислота). Белковые молекулы в матриксе возбуждаются с помощью лазерного излучения. В результате протонированные молекулы образца десорбируются из кристаллов, а образующиеся катионы, обычно имеющие один заряд ([M + H] + ), называются молекулярными ионами.В нормальных условиях их фрагментации не наблюдается, и аналогично работают спектрометры SELDI (surface-enhanced laser desorbion ionization). Они используют десорбцию ионизированных лазерным светом белковых молекул, следующих с разнотипной специфической поверхности связывания белка. Такие поверхности покрывают веществами, эквивалентными хроматографическим средам. SELDI используется в основном в клинической протеомике для скрининга. М/з - время пролета - ToF (время пролета), которые фиксируют время пролета ионизированных частиц (обычно 0,01-1 мс) и обратно пропорциональны величине m/z анализируемых ионов. По масс-спектру можно прочитать, сколько ионов с точно определенной массой насчитал детектор [3].
Масс-спектрометрия также используется для структурных исследований белков, особенно для их идентификации. Для этого очищенный белок сначала расщепляется на более мелкие фрагменты с помощью фермента (здесь используются такие протеазы, как химотрипсин, трипсин и коллагеноза).Полученные пептиды элюируют из геля и затем анализируют. На спектрометре MALDI-TOF получают спектр, который показывает массу отдельных пептидов. Это пептидная карта, характерная для каждого белка, обусловленная специфическим субстратом фермента. Примером может служить трипсин, который разрывает связи в белке всегда после аминокислотных остатков лизина и аргинина, а массы получаемых фрагментов зависят от положения этих двух аминокислот в последовательности белка. В результате расщепления полученные массы пептидов сравнивают с массами пептидов, полученными в результате расщепления in silico аминокислотных последовательностей, которые присутствуют в базах данных белков.Этот метод позволяет идентифицировать только ранее известные белки [2].
Другой метод идентификации белков и пептидов, тандемная масс-спектрометрия с индуцированной столкновением фрагментацией - CID MS/MS, позволяет проводить их одновременное секвенирование с использованием спектрометров с двумя анализаторами. В первом анализаторе выбранный молекулярный или фрагментационный ион выбирается из числа ионов, образующихся в процессе возбуждения. В камере столкновений осколочный ион подвергается столкновениям с атомами вводимого инертного газа (гелия или аргона), что приводит к распаду родительского иона на осколки (дочерние ионы).По массе дочерних ионов определяют аминокислотный состав данного пептида, ионы которого подвергались столкновениям в камере столкновений. Правильный комбинаторный анализ спектра дочерних ионов позволяет определить последовательность аминокислот в пептидной цепи. Использование такого подхода позволяет идентифицировать ранее неизвестные белки. Масс-спектрометры высокого разрешения, например с анализаторами, использующими преобразование Фурье ядерного циклотронного резонанса - явление FT-ICR, позволяют определять молекулярную массу с точностью 10,-4,.Это позволяет с высокой точностью определять основной состав анализируемого иона [2].
В настоящее время популярны методологические подходы, использующие сопряжение устройств жидкостной хроматографии с масс-спектрометром (ЖХ-МС). При этом смеси белков или пептидов, полученные после ферментативного расщепления белков, разделяют методами жидкостной хроматографии, а затем анализируют на масс-спектрометрах различного типа. Элюат из хроматографической колонки вводят непосредственно в ионизационную камеру спектрометров ESI, либо хроматографические фракции собирают и сокристаллизуют с матрицей на соответствующих пластинах, а затем анализируют на спектрометрах MALDI-TOF.Двумерный анализ, где первым измерением является время удерживания на хроматографической колонке, а вторым измерением является значение m/z, способствует одновременному обнаружению в смеси нескольких сотен белков [2].
Основные задачи клинической протеомики
Основной задачей клинической протеомики является выявление различий в протеоме здоровых и больных людей, связи между состоянием протеома и течением заболевания, а также изменения белковых профилей, инициированные в ответ на терапевтическое средство.Такие факторы называются биомаркерами или маркерами, и их состояние и количество указывают на риск заболевания, процессы прогрессирования заболевания и эффекты ответа на терапевтическое вмешательство. Таким образом, целью клинической протеомики является выявление и характеристика белковых биомаркеров, которые используются в молекулярной диагностике заболеваний [4].
В медицинской диагностике предметом клинических протеомных исследований может быть ткань или орган-мишень, в которых развивается заболевание, или замещающая ткань.Чаще всего это кровь или производный материал (плазма или сыворотка). В крови находятся клетки и продукты их метаболизма, как те, в которых развивается болезненный процесс, так и те, которые контактируют с больным органом или тканью (например, клетки иммунной системы). Анализируя сыворотку или плазму крови, можно получить картину набора белков и пептидов, характерную для данного индивидуума (белковый профиль, масс-спектр). Затем с помощью методов математического анализа сравнивают профили, характерные для здоровых и больных людей.При этом ищутся дифференцирующие «пики». В лучшей системе должно быть выявлено наличие белков в таких дифференцирующих «пиках», а изменение уровня идентифицированного биомаркера проверено другими методами (например, иммунологическими) [5].
Одним из возможных применений анализа протеома крови с помощью масс-спектрометрии является молекулярная диагностика рака. Причиной, а также следствием опухолевого заболевания могут быть изменения профиля пептидов и белков крови. В любом случае они должны показывать патологическое состояние органа и всего организма, что позволяет диагностировать заболевание.В настоящее время ведется поиск набора меток, в котором каждый компонент в отдельности имеет небольшую диагностическую ценность, но в целом они обладают высокой специфичностью и чувствительностью. Панель маркеров с несколькими или несколькими десятками компонентов называется классификатором. У них уровни экспрессии выбранных генов отобраны методами функциональной геномики. Предполагается, что анализ многокомпонентных наборов белков и пептидов, выделенных из сложных протеомных профилей сыворотки крови, будет иметь важное значение в клинической практике [6].Анализ протеома ткани-мишени является гораздо более надежным источником информации о раке, чем исследование замещающей ткани. Однако при скрининге, раннем выявлении доклинического заболевания, обнаружении микрометастазов или диагностике новообразований, леченных без хирургического вмешательства, анализ протеома крови является важным методом диагностики [7].
Протеом сыворотки больных раком можно анализировать методами масс-спектрометрии.Первая работа в этой области была опубликована командой Петрикоина и Лиотты в 2002 году. Они использовали метод SELDI-TOF для выявления в сыворотке крови пептидов, специфичных для больных раком яичников. В последние годы появилось много публикаций о полезности методов масс-спектрометрии, в основном MALDI-ToF и SELDI-TOF, для анализа низкомолекулярной фракции пептидов сыворотки (иногда плазмы) у онкологических больных. Изучение профилей белков сыворотки крови позволило выявить классификаторы (многокомпонентные белковые маркеры), которые используются при раннем выявлении новообразований и их диагностике.Масс-спектрометрия использовалась для анализа протеома сыворотки крови при диагностике рака области головы и шеи, молочной железы, яичников, матки, предстательной железы, легких, толстой кишки, поджелудочной железы, щитовидной железы, почек, мочевого пузыря и печени. Изучение изменений белково-массовых профилей сыворотки крови у больных, получающих противораковую терапию, могло бы повлиять на идентификацию молекулярных маркеров, позволяющих отслеживать реакцию больного на применяемую терапию (например, ее эффективность, токсичность) [7].
Анализ профиля белка на спектрометре MALDI-ToF (рис.2) имеет много преимуществ как аналитический и диагностический метод. Он имеет возможность прямого анализа сложных смесей и анализа нескольких образцов за короткое время и в стандартных условиях. Можно предположить, что в ближайшем будущем этот метод станет одним из основных методов молекулярной диагностики рака [7].
Рис. 2. Принципиальная схема спектрометра MALDI-ToF [15].
Во многих исследованиях, посвященных анализу протеома крови людей, больных раком, использовался анализ масс-спектров, которому предшествовало хроматографическое разделение смеси, так называемаяМетод ЖХ-МС [8]. Это позволяет повысить чувствительность анализа и охарактеризовать белки, присутствующие в крови в концентрациях ниже 10 -12 М. С другой стороны, соединение жидкостного хроматографа с тандемным масс-спектрометром ЖХ/МС/МС позволяет непосредственная идентификация разделенных белков и, таким образом, создание подробных карт сывороточных белков. На основании анализа современных данных представляется, что обильным источником потенциальных маркеров являются фракции пептидов и белков с низкой молекулярной массой, менее нескольких тысяч Да.Белки и пептиды с молекулярной массой менее 20-30 кДа удаляются из кровотока путем фильтрации в почках и поэтому являются нестабильными маркерами физиологического состояния организма. Очевидно, что эти небольшие белки и пептиды часто образуют комплексы с другими белками сыворотки, главным образом с альбумином, что увеличивает продолжительность их присутствия в кровотоке. Такой анализ проводили на крови больных раком яичников. Это позволило распознать во фракции сыворотки специфические фрагменты белков, активных в неопластическом процессе, например фрагмент белка BRCA2 [9].
Развитие методов масс-спектрометрии позволяет идентифицировать широкий спектр белков. Показано, что большинство идентифицированных биомаркеров патологического процесса представляют собой белки или их фрагменты, физиологически присутствующие в сыворотке крови в высоких концентрациях, например фибриноген и фибринопептиды, гемоглобин, амилоид А или аполипопротеин А [10]. Открытие того, что среди потенциальных опухолевых биомаркеров присутствуют специфические фрагменты «физиологических» сывороточных белков, привлекло внимание исследователей к необходимости изучения низкомолекулярной фракции сывороточных пептидов с молекулярной массой менее 3000 Да.Проведен анализ и идентификация 61 пептида сыворотки от разных больных тремя видами рака (рак молочной железы, предстательной железы и мочевого пузыря) и здоровых людей. Классификатор, состоящий из 61 пептида, отличал здоровых пациентов от больных, а также дифференцировал пациентов с разными видами рака. Это доказывает, что классификатор был маркером определенного вида рака [11].
Вопросы, связанные с характеристиками биомаркеров, которые определяют их полезность в клинической практике, также включают чувствительность и специфичность.Чувствительность маркера определяется как отношение, выраженное в процентах, правильно идентифицированных с его помощью образцов от пациентов. С другой стороны, специфичность определяет количество образцов от здоровых людей, ошибочно идентифицированных с его помощью как больных. В случае многокомпонентных белковых маркеров, отобранных путем анализа масс-спектров белков сыворотки, чувствительность и специфичность были очень высокими, многократно превышающими 90%. Важно, что выбранные пептидные маркеры часто не позволяют отличить новообразования на разных стадиях развития.Несмотря на эти сомнения, трудно игнорировать диагностические преимущества использования пептидных маркеров. Использование панели пептидов, идентифицированных методом масс-спектрометрии, в сочетании с традиционными маркерами существенно повышает диагностическую ценность исследования. Примером может служить комбинированный анализ нескольких белков, отобранных на основе МС-анализа и «традиционного» маркера СА125 (раковый антиген 125 кДа). Такая комбинация улучшает выявление ранних стадий карциноидов [12].
Исследования в области протеомики также в значительной степени связаны с анализом опухолевых клеток и тканей.В этом случае применение масс-спектрометрии заключается в идентификации белков опухолевых клеток после их разделения методами электрофореза. Также предпринимаются попытки использовать масс-спектрометрию как метод молекулярной визуализации опухолевой ткани. В этом методе (называемом МС с визуализацией) времяпролетные спектрометры ионизируют белки, находящиеся на поверхности клеток или гистологических срезов. Затем делают масс-спектры белков препарата в различных положениях. С другой стороны, белковые профили коррелируют с микроскопическим изображением.Такой анализ может быть использован для классификации новообразований, что важно в клинической диагностике [13].
Известным методом является также лазерная микродиссекция, которая используется для выделения отдельных клеток из окружающей среды. Опухолевые клетки, выделенные этим методом, также можно анализировать методами масс-спектрометрии. Благодаря высокой чувствительности спектрометров ЖХ-МС-анализ можно проводить на материале из нескольких тысяч «разрезанных» клеток (это соответствует нескольким сотням нанограммов общего белка).В более простом методе SELDI-TOF воспроизводимые белковые профили получаются даже для нескольких десятков или нескольких сотен «вырезанных» клеток [14].
Внедрение протеомных технологий и их постоянное совершенствование дают надежду на их применение в диагностике заболеваний. Интенсивное развитие методов исследования и их применение в сочетании с универсальным методом масс-спектрометрии в ближайшие годы даст возможность предоставить потенциальные аналитические методы. Появятся ли они на постоянной основе в методах клинической протеомики и молекулярной диагностики новообразований, будет зависеть от возможности внедрения их в медицинскую практику [7].
Резюме
Большие надежды возлагаются на развитие клинической протеомики, задачей которой является анализ изменений протеома, отражающих развитие болезненного процесса, а также эффекты терапии. Таким образом, клиническая протеомика дополняет диагностику пациента и поддерживает его лечение благодаря подбору лучших терапевтических методов. Не исключена возможность использования в будущем интегрированных аналитических микросистем, которые позволят проводить быстрый анализ белкового профиля и завершать идентификацию генетических дефектов.Несомненно, методы, используемые в клинической протеомике, еще нуждаются во многих усовершенствованиях и стандартизации. К ним относятся методы отбора, подготовки и отбора проб, методы предварительного разделения белков, а также количественного и качественного определения их состава и выбора правильных методов поиска в базах данных, биоинформатического и статистического анализов. Новые диагностические методы могут быть внедрены в клиническую практику, когда их полезность будет продемонстрирована в обширных, хорошо спланированных и контролируемых проверочных тестах.Однако это требует усилий, терпения и тщательных методов стандартизации.
Новым перспективным направлением клинической протеомики является исследование протеома сыворотки (или плазмы) крови методами масс-спектрометрии. Важной особенностью современных масс-спектрометров является их высокая точность и чувствительность, что позволяет анализировать молекулы, присутствующие в сложных смесях в концентрациях ниже 10 ~ 12 М. Это дает возможность поиска потенциальных маркеров опухолевого образования в такой сложной смеси, как сыворотка крови.Этот метод также может использоваться отдельно и может использоваться для помощи в обнаружении и диагностике новообразований и в мониторинге их терапии.
Методы масс-спектрометрии, применимые к клинической протеомике, также имеют ограничения. Метод масс-спектрометрии не является количественным методом, увеличение «пика» в масс-спектре не обязательно должно быть напрямую связано с увеличением концентрации молекул. Важной проблемой, в связи с многоэтапной процедурой пробоподготовки к анализу в спектрометрах MALDI и SELD1, является стандартизация методики между лабораториями, особенно когда результаты могут быть не только качественными.Масс-спектрометр регистрирует все типы молекул, обнаруженных в жидкостях организма. Основными белками, обнаруживаемыми в сыворотке крови, являются альбумины и иммуноглобулины. Наличие альбумина (составляющего около 60% всех белков сыворотки) является фактором, влияющим на качество анализа белков и пептидов, являющихся мишенью теста. Удаление его из препарата перед проведением анализа является серьезной методологической проблемой. Еще одна проблема метода — огромное количество данных, генерируемых за один анализ, что требует использования передовых аналитических и математических методов.Несмотря на эти ограничения, масс-спектрометр имеет много преимуществ. Он позволяет проводить прямой анализ сложной белковой смеси, обладает высокой чувствительностью и устойчивостью к загрязнению анализируемых образцов. Кроме того, многие образцы можно проанализировать за короткое время в стандартных условиях, а стоимость одного анализа невелика. Существует гипотеза, что методы клинической протеомики навсегда будут составлять базовый набор методов молекулярной диагностики и облегчат врачам принятие правильных диагностических и терапевтических решений.
Автор: Катажина Чуба
Литература :
1. Тайерс М., Манн М. От геномики к протеомике. Природа. 2003. 422, 193-197.
2. Эберсолд Р., Манн М. Протеомика на основе масс-спектрометрии. Природа. 2003, 422, 198-207.
3. Мазуркевич Р. Масс-спектрометрия, в кн.: Спектроскопические методы и их применение для идентификации органических соединений. ВНТ. 2000, 436-537.
4-й Азад Н.С., Расул Н., Аннунциата С.М., Минасян Л., Уайтли Г., Кон Э.К. Протеомика в клинических испытаниях и практике. мотылек Клеточная протеомика. 2006. 5, 1819-1829.
5. Ахмед Н., Олива К.Т., Баркер Г., Хоффманн П., Рив С., Смит И.А., Куинн М.А., Райс Г.Е. Протеомное отслеживание изоформ сывороточного белка в качестве скрининговых биомаркеров рака яичников. Протеомика. 2005. 5, 4625-4636.
Лиотта Л.А., Феррари М., Петрикоин Э.Ф. Клиническая протеомика: написано кровью. Природа. 2003. 425, 905.
7.Петрикоин Э.Ф., Ардекани А.М., Хитт Б.А., Левин П.Дж., Фусаро В.А., Стейнберг С.М., Миллс Г.Б., Симоне К., Фишман Д.А., Кон Э.К., Лиотта Л.А. Использование протеомных паттернов в сыворотке для выявления рака яичников. Ланцет. 2002, 359, 572-577.
8. Мартоселла Дж., Золотарёва Н., Лю Х., Николь Г., Бойс Б.Е. Высокоэффективное жидкостно-хроматографическое предварительное фракционирование с обращенной фазой белков сыворотки человека с ослабленным иммунитетом для улучшения идентификации белков с низким содержанием с помощью масс-спектрометрии. Дж. Протеом Рез.2005. 4, 1522-1537.
9. Ловенталь М.С., Мехта А.И., Фрогейл К., Бандл Р.В., Араужо Р.П., Худ Б.Л., Веенстра Т.Д., Конрадс Т.П., Голдсмит П., Фишман Д., Петрикоин Э.Ф., Лиотта Л.А. Анализ связанных с альбумином пептидов и белков у больных раком яичников. клин. хим. 2005. 51, 1933-1945.
10. Хортин Г.Л. Масс-спектрометрический вид MALDI протеома и пептидома плазмы. клин. хим. 2006. 52, 1223-1237.
11. Вильянуэва Дж., Шаффер Д.Р., Филип Дж., Чапарро К.А., Эрджумент-Бромаж Х., Олшен А.Б., Флейшер М., Лилья Х., Броги Э., Бойд Дж., Санчес-Карбайо М., Холланд Э.К., Кордон-Кардо К., Шер Х.И., Темпст П. Дифференциальная экзопротеазная активность придает опухолеспецифические пептидомные структуры сыворотки. Дж. Клин. Инвестировать. 2006. 116, 271-284.
90 134назад Поделись с друзьями .
Последипломная педиатрия - 3-метилкроссонилглицинурия - наиболее часто выявляемая...
Jolanta Sykut-Cegielska, 1 Mariusz Ołtarzewski, 1 Joanna Taybert, 2 Agnieszka Kowalik, 1 Dorota Korycińska-Chaaban, 2 Ewa Jabłońska 1
Адрес для корреспонденции: Dr hab. доктор медицинских наук Иоланта Сыкут-Цегельска Отделение скрининга, Институт матери и ребенка, ул. Kasprzaka 17A, 01-211 Варшава, e-mail: [email protected]
Диплом педиатра 2014. 18 (4): 35-41
Ключевые слова
3-метилкротонилглицинурия, масс-спектрометрия, дефицит 3-метилкротонилкоэнзима А карбоксилазы
Введение
Благодаря неонатальному скринингу с помощью тандемной масс-спектрометрии, широко применяемой в последнее время в диагностике редких врожденных метаболических дефектов, выявлены многочисленные случаи заболеваний с недоказанной клинической значимостью (в том числе 3-метилкротонилглицинурия).Часто выявленные новорожденные не проявляют никаких тревожных симптомов в течение длительного периода наблюдения. Поэтому возникают сомнения в необходимости введения лечебного вмешательства в виде: изменения рациона питания ребенка (ограничение природного белка, особенно лейцина), фармакотерапии (добавка L-карнитина), постоянных рекомендаций избегать длительного голодания и немедленных действий в ситуациях повышенный катаболизм (риск метаболической декомпенсации). Несмотря на приведенные выше рекомендации, большинство клиницистов подтверждают необходимость наблюдения за течением заболевания, несмотря на возникающие утверждения о медикализации. 1
Что такое 3-метилкротонилглицинурия (дефицит MCC)?
Рис. 1. Схема конверсии лейцина с указанием места дефицита МКЦ.
3-метилкроссонилглицинурия (3-MCG) является относительно новым заболеванием, впервые описанным в 1984 году, 2 , хотя ранее были опубликованы сообщения об отдельных случаях без выявления метаболических нарушений. Термин 3-метилкротонилглицинурия описывает явление повышенной экскреции 3-метилкротонилглицина с мочой, сопровождающееся выделением 3-гидроксиизовалериановой кислоты (3-HIVA) и, возможно,тиглилглицин, анализировали с помощью газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией (ГХ/МС). В редких случаях в тесте ГХ/МС единственным аномальным метаболитом, обнаруживаемым в моче, является 3-HIVA без (до недавнего времени считавшегося патогномоничным) повышенной экскреции MCG. 3 Биохимическим маркером крови является повышенная концентрация 3-гидроксиизовалерилкарнитина (C5OH), обнаруженная в сухой капле крови. Это связано с изолированным дефицитом 3-метилкротонил-кофермента А (дефицит 3-метилкротонил-КоА-карбоксилазы, дефицит МКЦ) карбоксилазы.Фермент МКЦ участвует в превращении одной из аминокислот с разветвленной цепью, т.е. лейцина; позволяет превратить 3-метилкроссонилкоэнзим А в 3-метилглутаконилкофермент А (рис. 1). Это одна из четырех карбоксилаз, участвующих в цикле метаболизма биотина, и поэтому потенциально является биотинзависимым ферментом. Подтверждение дефицита фермента МКЦ у пациентов без повышенной экскреции МКГ послужило основанием для предложения переименовать 3-МКГ в дефицит МКЦ. 3 Дефицит MCC наследуется по аутосомно-рецессивному типу.Ответственны мутации в гене MCCC1 (ранее MCCA ), кодирующем альфа-субъединицу фермента, или MCCC2 (ранее MCCB ), кодирующем бета-субъединицу этого фермента. Ген МССС1 состоит из 19 экзонов и расположен на хромосоме 3q25-q27, а МССС2 с 17 экзонами - 5q12-q13. 4 Среди обнаруженных на сегодняшний день мутаций в этих генах нонсенс, миссенс, сдвиг рамки считывания, делеция, небольшие вставки и мутации сайта сплайсинга. 5
Распознавание и фенотип дефицита MCC до начала неонатального скрининга
Дефицит МКЦ до недавнего времени считался одной из классических органических ацидурий из группы редких врожденных дефектов непрямого метаболизма аминокислот с разветвленной цепью, которые в результате ферментативного блока приводят к накоплению карбоновых кислот , что вызывает симптомы, напоминающие острое отравление, т.е. синдром интоксикации. Клиническая картина дефицита МКЦ в основном включала повторяющиеся эпизоды клинической декомпенсации (связанной с состояниями повышенного катаболизма или избыточной белковой нагрузки) и нарушения функции печени в виде синдрома Рейе, гипогликемии и неврологической симптоматики (гипотония, судороги, дистония, инсульт- как эпизоды, лейкодистрофия, задержка развития) психомоторные). 6-8 Характерным для заболевания является также особый запах, который ощущается от больных людей, напоминающий запах кошачьей мочи. После установления диагноза в основу процедуры было положено применение диеты с ограничением натуральных белков с использованием безлейциновых пищевых продуктов для специальных лечебных целей, с рекомендацией обеспечения калорийности при состояниях повышенного катаболизма и приема карнитина при состояниях повышенного катаболизма. случае его дефицита.
Распознавание и фенотип дефицита MCC в настоящее время
Недавно проведенный скрининг новорожденных методом тандемной масс-спектрометрии (тандемная МС, МС/МС) выявил другую сторону этого врожденного метаболического дефекта.Оказалось, что повышенная (выходящая за пределы референтного диапазона) концентрация С5ОН, выявляемая в сухой капле крови, является очень частым скрининговым отклонением; по Баумгартнеру и др. у 1 из 50 000 новорожденных, 9, по Арнольду и др. у 1 из 36 000 новорожденных. 1 При этом значительно расширился спектр наблюдаемых симптомов дефицита МКЦ - от тяжелых неонатальных форм до бессимптомных, вплоть до зрелого возраста. Разнообразие клинической картины (фенотипа) может иметь место даже в пределах одной семьи, имея при этом один и тот же генотип.В исследовании Grünert и др. Среди 8 пациентов, у которых в рамках семейной диагностики был диагностирован дефицит MCC, у 3 не было симптомов, еще у 3 симптомы присутствовали, а об остальных 2 данных нет. 10 Клинические симптомы включали: задержку психомоторного развития, задержку речевого развития, снижение мышечного тонуса, двигательную гиперактивность и нежелание есть мясо. В рамках семейного диагноза мальчика 4 лет с дефицитом МКЦ (гипотонией и умеренной задержкой моторного развития) у его 17-летнего брата это нарушение было выявлено бессимптомно, а в случае мальчика с атонической судороги и метаболический ацидоз, диагностированные в младенчестве (диагностированы при селективном скрининге) - дефицит МКЦ подтвержден у 3-летнего брата с задержкой речевого развития и макроцефалией.
Visser и др. Описали наличие дефицита MCC у 7-недельной девочки с дилатационной кардиомиопатией, ее 10-летнего брата с умственной отсталостью, а также у их здорового отца. Диагноз у последних двух был установлен в рамках семейной диагностики после выявления каких-либо отклонений у младенца. В заключение, однако, авторы предположили, что в этой семье нельзя исключить разный генотип у отдельных членов семьи. 11
Установление окончательного диагноза еще больше затрудняет возможность выявления материнской вариации у новорожденного с помощью МС/РС.Известно, что мать с дефицитом МКЦ (обычно не подозревая об этом), находящаяся на грудном вскармливании, передает ребенку метаболиты, которые выявляются при скрининговом тесте. Со временем, по мере того как рацион младенца расширяется за счет включения других продуктов, показатели профиля ацилкарнитина нормализуются. Таким образом, скрининг новорожденных методом МС/МС позволяет выявить врожденный дефект обмена веществ не только у новорожденных, но иногда и у их взрослых матерей (собственный материал). 10.12 Несмотря на частое отсутствие данных в анамнезе о тревожных симптомах (бессимптомное или слабосимптомное течение), существует риск клинического выявления дефицита МКЦ в ситуациях, связанных с повышенным катаболизмом (операции, тяжелые инфекции, длительное голодание).У некоторых из них ранее были обнаружены состояния метаболической декомпенсации, связанные с инфекциями (собственный материал). 10
Проанализировано течение заболевания в группе из 14 больных, выявленных при скрининговых обследованиях новорожденных (в возрасте 1,75-6,5 лет), а также их четырех сибсов (в возрасте 4,5-12,25 лет) и 7 матерей (в возрасте 22-38 лет). диагностируется во время расширенных семейных обследований. 13 Все были бессимптомными, за исключением одного ребенка с задержкой речевого развития и двух детей с непереносимостью физической нагрузки и слабостью конечностей в анамнезе.Авторы проанализировали 37 ранее опубликованных случаев, которые выявили, что 27% случаев были бессимптомными, 11% детей умерли, 32% имели психомоторную заторможенность, 16% имели судорожные припадки и 49% имели неспецифическую неврологическую симптоматику. На основании вышеприведенных данных было высказано предположение, что, возможно, не все симптомы могут быть связаны с дефицитом МКЦ, а повышенная концентрация С5ОН при скрининге может не иметь клинического значения. Противоположное мнение было высказано в более позднем исследовании Grünert et al. 10 Проанализированы клинические, биохимические, ферментативные и молекулярные данные в группе из 88 пациентов с диагностированной недостаточностью МКЦ, в том числе у 53 (60 %), выявленных при неонатальном скрининге, у 26 (30 %) диагностированных на основании клинических симптомов или как часть семейных тестов и у 9 (10%) матерей (24-38 лет), выявленных при дифференциальной диагностике выявленных аномалий у новорожденных. Было три смерти. Во-первых, при внезапной остановке сердца в возрасте 33 дней у ребенка, выявленного при неонатальном скрининге, с тяжелой метаболической декомпенсацией с первого дня, гипогликемией, гипераммониемией и лактоацидозом.Вторая смерть произошла у 6-недельного ребенка с генерализованной вялостью, миоклоническими судорогами и острой метаболической декомпенсацией. Третья смерть наступила у 8-летней девочки, у которой, однако, сердечные симптомы (желудочковая тахикардия и внезапная остановка сердца), по-видимому, вызваны обнаруженными мутациями в гене рианодинового рецептора RyR2, , ответственного за аномальные приток кальция в клетки сердечной мышцы, т.е. заболевание, причинно не связанное с дефицитом МКЦ.У 80 пациентов (т.е. более 40%; по 8 случаям отсутствовали данные) клинические симптомы варьировали от тяжелых метаболических декомпенсаций (с энцефалопатией, кетоацидозом и гипогликемией) до мышечных симптомов, нарушений развития, дефицита внимания и гиперактивности. Из 53 детей, у которых был диагностирован неонатальный скрининг, у 36 не было симптомов, а у 13 были различные клинические симптомы (данные отсутствуют в четырех случаях). Это означает, что почти у каждого четвертого ребенка, выявленного в досимптомную фазу, обнаруживались клинические симптомы дефицита МКЦ.В том числе в пяти случаях имели место развернутые явления метаболической декомпенсации. Интересно, что в случаях выявленного дефицита МКЦ материнского генеза у одной матери отмечалась хроническая усталость и отсутствовали тревожные симптомы, а у другой – рецидивирующая метаболическая декомпенсация на фоне лихорадочных инфекций, а также кардиомиопатии, парестезии и эпизод инсульта.
Собственные результаты анализа случаев, диагностированных в Польше, показали высокую выявляемость дефицита МКЦ при скрининге новорожденных, т.е.по МС/МС. 14 Дефицит МКЦ диагностирован у 42 человек, в том числе при выборочном скрининге выявлено 11 случаев, при семейной диагностике - 5 случаев, при скрининговом обследовании новорожденных выявлено 19 детей и 7 матерей. Кроме группы пациенток, диагностированных в рамках выборочного скрининга, и одной из матерей (имеющей в анамнезе синдром Рейе неясной этиологии в возрасте 9 лет) тревожных симптомов не наблюдалось. Однако самый длительный период наблюдения за больными, выявленными при неонатальном скрининге, составил всего 10 лет, а поздний возраст проявления дефицита МКЦ в анализируемой группе симптомных больных — 12 лет.
Среди 11 симптомных пациентов отмечались рвота (у 4), судороги или их эквиваленты (у 5), психомоторная заторможенность (у 3) и другие неврологические симптомы. Только у одного пациента была диагностирована гипогликемия.
Концентрация С5ОН-карнитина в сухой капле крови при постановке диагноза составляла 0,72-41,0 мкмоль/л у симптомных больных и 0,51-31,5 мкмоль/л (референсные значения <0,47 мкмоль/л) у обследованных пациентов. Значительное повышение С5ОН в сухом пятне крови (>3,00 мкмоль/л) выявлено в 45 и 48% случаев, диагностированных при селективном скрининге и неонатальном скрининге соответственно.При постановке диагноза, независимо от диагностического метода, выделение 3-HIVA и MCG было достигнуто у всех пациентов, кроме одного, который оставался необнаружимым в течение 11 месяцев последующего наблюдения. Массивное повышение уровней 3HIVA и MCG, определяемое как более 500 ммоль/моль креатинина и 200 ммоль/моль креатинина (референтные значения <20 и неопределяемый соответственно), было обнаружено примерно у половины пациентов с диагнозом как симптоматическая, так и предсимптомная диагноз.
Рис. 2. Схема процедуры при повышенной концентрации C5OH в МС/МС.
У матерей с дефицитом МКЦ отмечалось достоверное повышение концентрации С5ОН в сухой капле крови в пределах 10,2-54,1 мкмоль/л.
Ввиду сложности диагностического процесса при дефиците МКЦ авторы предлагают использовать диагностический алгоритм (рис. 2), который должен помочь в процессе дифференциации возможных причин повышения концентрации С5ОН у новорожденного.
Таблица. Первичные исследования в случае повышенной концентрации C5OH в скрининговом тесте новорожденных
.Предмет - Медицинская лаборатория
Целью каждого химика-аналитика и лабораторного диагноста является определение концентрации аналита с максимально возможной чувствительностью и точностью. Задача усложняется тем, что в случае клинических образцов искомый аналит (или аналиты) маскируется компонентами сложных матриц - биологическими жидкостями, такими как цельная кровь, сыворотка, плазма или моча. Часто искомое соединение химически сходно с другими компонентами матрицы.За эти годы были разработаны методы, которые должны были достичь поставленной цели и, как следствие, получить достоверный и достоверный результат. Перед лабораторной диагностикой стояла еще одна задача: методы должны быть просты в исполнении, а их стоимость относительно невысока, чтобы обеспечить доступность анализов для каждого пациента, охваченного системой медицинского страхования. Эти критерии означают, что достичь поставленной цели непросто, и производители вынуждены постоянно совершенствовать существующие методы и искать новые технические решения.Это направление предоставляет большое поле для действия инновационных решений, предлагаемых новыми игроками рынка. Несомненно, что после окончания первого этапа, основанного на методах с колориметрическим детектированием, и в ходе продолжающегося второго этапа, основанного на методах иммуноферментного анализа, третий этап будет принадлежать масс-спектрометрии. Для целей данной статьи и обеспечения ее прозрачности авторы приняли некоторые упрощения, которые являются их собственной точкой зрения, но основаны на предметных и технических знаниях, полученных за несколько лет профессиональной работы.
Лабораторные методы диагностики
В течение нескольких десятилетий был разработан ряд аналитических методов, которые до сих пор используются в обычных медицинских лабораториях по всему миру. Кратко их можно разделить на три группы:
I) методы с использованием цветных реакций (в том числе ферментативных) и фотометрическое детектирование. Сегодня они составляют большинство рутинно используемых методов;
II) методы, разработанные во второй половине 1970-х гг.и более поздние, основанные на иммуноферментных реакциях, отличающиеся высокой чувствительностью и более высокой специфичностью, чем первая группа описанных методов;
III) методы, основанные на масс-спектрометрии в сочетании с высокоэффективной жидкостной хроматографией. Это относительно новое явление в области диагностики, так как их разработка началась в конце 20-го века.
Эти три группы методов послужат основой для дальнейшего рассмотрения их преимуществ и недостатков и их будущего использования.
Методы иммуноферментного анализа (ИФА)иммуноферментный анализ) характеризуется низкой специфичностью и невозможностью различения сферических конформаций. Очень хорошим примером является определение концентрации витамина D2/D3 и третьего эпимера витамина D3.
Анализируя структурные формулы, нелегко увидеть разницу в структуре кальциферолового и холокальциферолового колец. С другой стороны, витамин D3 отличается от третьего эпимера только расположением гидроксильной группы в пространстве. Эта изомерия связана со значительной разницей в биологической активности обеих форм (рис.1).
Аналогичным примером является циклобензаприн, структура которого аналогична встречающемуся в природе аминотриптилину (рис. 2).
Сходство структур не позволяет получить достоверный результат при использовании наборов реагентов, основанных на иммунохимическом принципе.
Несовершенство иммунохимических методов в части определения аналитов, мало отличающихся друг от друга, связано с технологией получения антител, составляющих основу наборов для иммунохимических определений.Сегодня вы можете рискнуть сказать, что это тупик, который может привести к ложным результатам. Помимо ограничений специфичности, второй серьезной проблемой является интерференция, которая, на наш взгляд, ставит под большой вопрос целесообразность использования иммунохимических методов во многих рутинных тестах.
Недостатки вышеуказанных двух групп методов лишены решения с помощью масс-спектрометрии, а именно спектрометров с тройным квадрупольным анализатором, которые являются идеальным инструментом для количественных определений.
Жидкостная хроматография
Наиболее часто используемые масс-спектрометры для лабораторной диагностики сочетаются с высокоэффективной жидкостной хроматографией - системой ВЭЖХ. Сам метод хроматографического разделения известен более 100 лет. В 1905 году русский ученый Михаил Цвет опубликовал первые работы по разделению растительных красителей. С годами техника хроматографии совершенствовалась за счет развития аппаратной части и хроматографических колонок, а также разработки новых приложений.Еще в середине двадцатого века наборы для жидкостной хроматографии стали использоваться для рутинных анализов в области клинической химии. К сожалению, сложность хроматографических наборов по сравнению со специализированными биохимическими и иммунологическими анализаторами не позволила жидкостной хроматографии стать популярным инструментом в руках диагностов. Скорее, он оказался нишевым методом в тех немногих центрах, где его использование было и необходимо для получения надежных лабораторных результатов.Наиболее распространенными сферами применения жидкостной хроматографии являются определение биогенных аминов, гомоцистеина, некоторых витаминов и мониторинг терапии отдельными лекарствами. Самыми большими ограничениями для широкого использования жидкостной хроматографии в рутинной работе являются несколько сложная работа с набором и необходимость выполнять хорошее хроматографическое разделение, что позволит избежать помех. Другими проблемами также являются необходимость использования разных детекторов и их иногда нестабильная работа (например,в случае электрохимического детектора). Все это вызывает нежелание диагностов к данной методике, что обуславливает ее низкую популярность. Идеальным решением были бы универсальный детектор и очень простой жидкостный хроматограф.
Масс-спектрометрия
В начале 20 века Джозеф Дж. Томсон разработал первый масс-спектрометр, который был далек от известных нам по современным лабораториям устройств. Как и в случае с жидкостной хроматографией, масс-спектрометрия за последние 100 с лишним лет претерпела огромный рост как в техническом, так и в прикладном плане.Современные решения превратились в устройства, обеспечивающие высокую чувствительность и селективность, а масс-спектрометры в то же время стали проще в использовании и даже надежнее. Среди широкого спектра доступных спектрометров решение, широко известное как масс-спектрометр — тройной квадруполь — использовалось в повседневной лабораторной диагностике. Это, безусловно, наиболее широко используемый спектрометр, который можно смело назвать эталоном.
Каждый набор для масс-спектрометрии состоит из трех компонентов: (1) системы ввода проб, (2) масс-анализатора и (3) программного обеспечения для управления набором.Чаще всего подготовленную пробу вводят в масс-анализатор с помощью жидкостного хроматографа, что обусловлено большой популярностью и доступностью методов, основанных на хроматографическом разделении. Единственным недостатком данного решения является относительно большое время разделения проб, что приводит к снижению производительности установки (количество анализов, выполняемых в час). Последние тенденции движутся к системам ввода образца в масс-анализатор без этапа хроматографии, что значительно сокращает время анализа и упрощает сам метод.В то же время он позволяет автоматизировать процесс пробоподготовки.
Масс-анализатор, или модуль спектрометра, состоит из трех элементов:
• источник ионов - самый важный элемент, т.к. от эффективности процесса ионизации зависит работа каждого последующего модуля. И ионная оптика, и детектор могут анализировать только ионы. Нейтральные частицы для них «невидимы». Образец в виде жидкости вводят в источник ионов, если используется жидкостный хроматограф.Задачей источника является ионизация аналитов, содержащихся в образце, и преобразование жидкости в газ. Наиболее популярным источником является ESI (ионизация электрораспылением), в котором используется явление электрораспыления;
• Ионная оптика состоит из двух масс-анализаторов и соединяющей их камеры столкновений, в которой происходит фрагментация псевдомолекулярных ионов с образованием фрагментационных ионов. Благодаря выбранному режиму мониторинга реакций (MRM) можно анализировать ионы фрагментации и получать качественную и количественную информацию об анализируемых химических соединениях.В дополнение к режиму работы MRM есть несколько других рабочих возможностей тройного квадрупольного спектрометра, но с точки зрения пригодности для рутинного анализа как по чувствительности, так и по селективности этот вариант является наиболее полезным.
Практическое применение масс-спектрометрии в лабораторной диагностике
Описанные выше преимущества тройного квадрупольного масс-спектрометра делают его идеальным инструментом для широкого спектра применений, позволяющим получать надежные результаты в короткие сроки, а стоимость анализа весьма конкурентоспособна с широко применяемыми иммунохимическими методами.
Наиболее часто проводимые исследования включают:
• скрининг новорожденных на нарушения обмена веществ;
• определение стероидных гормонов;
• определение иммунодепрессантов и микофеноловой кислоты;
• контролируемая медикаментозная терапия;
• определение витамина D2/D3;
• биогенный аминовый профиль.
Резюме
Масс-спектрометрия нашла место в рутинной лабораторной диагностике, хотя в Польше это только начало.Этот метод обеспечивает уникальную чувствительность и селективность анализов. Он идеально подходит для определения менее распространенных аналитов, для которых еще не разработаны наборы реагентов, основанные на типичных иммунохимических реакциях. Преимущества этой методики неоспоримы, и вполне логично, что присутствие масс-спектрометров в медицинских диагностических лабораториях становится все более и более логичным.
.Метод ЖХ-МС/МС и его применение в рутинной медицинской диагностике
Tomasz BienkowskiЛаборатория Masdiag
страницы печатной версии: 7-21 В 1980-х годах, когда был разработан первый тройной квадрупольный масс-спектрометр, потенциал этой технологии был проверен. В полученном отчете оценочное количество проданных устройств составило более дюжины в год по всему миру. Несмотря на не очень многообещающие перспективы, было принято решение начать производство и продажу.Первыми пользователями методики ЖХ-МС/МС были крупные фармацевтические компании. Только у них были ресурсы, чтобы инвестировать в этот тип технологий, и они видели его потенциал. Тройной квадруполь в сочетании с высокоэффективным жидкостным хроматографом оказался идеальным прибором для количественного анализа полярных органических соединений в сложной матрице, которой является кровь. Так началась разработка методики ЖХ-МС/МС. В настоящее время этот метод используется в самых разных приложениях и постоянно развивается.Появляются и постоянно совершенствуются новые типы масс-спектрометров. Одним из наиболее важных приложений является количественный анализ. Везде, где необходимо быстро и точно определить выбранный аналит или всю его панель, наилучшим решением является система, состоящая из тройного квадрупольного спектрометра и высокоэффективного жидкостного хроматографа. Поэтому метод ЖХ-МС/МС все чаще используется в лабораторной диагностике, где он обычно используется для количественного определения различных биомаркеров.Вопрос в том, почему тройные квадрупольные спектрометры наиболее популярны в диагностике и вообще в количественном анализе? Чтобы ответить на них, необходимо объяснить, как работает масс-спектрометр. Схема масс-спектрометра представлена на рис. 1. Рис. 1. Конструкция масс-спектрометра (на примере тройного квадруполя). Первый этап – ионизация анализируемых веществ при атмосферном давлении. Затем ионы переносятся в масс-анализаторы в высоковакуумной части спектрометра.Они используются для анализа/разделения ионов на основе отношения их массы к заряду (m/z). В зависимости от режима работы спектрометра ионы после разделения попадают в детектор или в камеру столкновений. В камере столкновения они подвергаются фрагментации (CID - Collision Induced Dissociation), вызванной ударом. Полученные ионные фрагменты повторно разделяются на основе отношения их массы к заряду вторым масс-анализатором и поступают в детектор. Тип детектора зависит от типа используемого масс-анализатора.Наиболее важными шагами, определяющими правильный выбор масс-спектрометра для применения, являются метод ионизации и тип используемых масс-анализаторов.
Методы ионизации
Коммерчески доступные системы ЖХ-МС/МС используют три метода ионизации при атмосферном давлении. Наиболее распространенным методом является электрораспыление (ESI - Electrospray). В этом методе ионы переходят из жидкой фазы в газовую. Поэтому анализируемые соединения, хотя и в небольшой степени, должны быть ионизированы в жидкой фазе.Эффективность метода электрораспыления тем выше, чем более полярно соединение. Другой метод — химическая ионизация при атмосферном давлении (APCI). В этом методе ионы образуются в газовой фазе. Это обеспечивает эффективную ионизацию менее полярных соединений, таких как эргокальциферол и холекальциферол (витамины D2 и D3 соответственно). Фотораспыление (APPI - Фотоионизация при атмосферном давлении) представляет собой метод, позволяющий ионизировать наименее полярные соединения.В этом случае ионы также образуются в газовой фазе. Этот метод можно использовать, например, при определении панелей стероидных гормонов. Первой стадией ионизации в APCI и APPI является полное испарение растворителя, в результате чего молекулы аналита подвергаются тепловому стрессу. Это ограничивает применимость этих типов ионизации к соединениям, устойчивым к повышенным температурам и имеющим максимальную молекулярную массу примерно до 1000 дальтон. Из описанных выше способов наиболее мягким методом ионизации является электрораспыление.Он обеспечивает ионизацию термолабильных и наиболее крупных частиц. Сфера применения описанных методов в зависимости от полярности и размера частиц представлена на рисунке 2. Рис. 2. Диапазон оптимальной эффективности ионизации при атмосферном давлении. Следует помнить, что большинство соединений ионизируются всеми методами. Однако в зависимости от полярности соединения и его молекулярной массы один из этих методов является наиболее оптимальным. Эффективность ионизации зависит от многих факторов, и это вносит некоторую изменчивость в результаты.В методах ЖХ-МС/МС метод считается очень хорошим, если коэффициент вариации составляет менее 5%.Типы масс-анализаторов
АнализаторKwadrupol наиболее часто используется в тандемных масс-спектрометрах. Он работает непрерывно, пропуская ионы с заданным отношением массы к заряду. Он может работать в двух режимах: сканирование, когда выполняется полный спектр, и в режиме наблюдения выбранного иона, когда во времени регистрируется интенсивность выбранного иона.Сканирование дает информацию о составе тестируемого образца. Квадрупольный анализатор в этом режиме работает с очень низкой эффективностью, до детектора доходит менее 0,1% ионов. С другой стороны, в выбранном режиме наблюдения ионов квадруполь работает с максимальной эффективностью и обеспечивает наибольшую чувствительность измерений. Это наиболее чувствительный режим работы масс-спектрометров, позволяющий максимально использовать ионы.
Времяпролетный анализатор (TOF) работает периодически. Отношение массы к заряду рассчитывается по времени пролета иона через анализатор.Ионы ускоряются приложением потенциала. Ионы с меньшим отношением массы к заряду набирают большую скорость и быстрее достигают детектора. Время прохождения через анализатор можно очень точно измерить и определить точную массу ионов. В спектрометрах, оснащенных источником, работающим при атмосферном давлении, в котором непрерывно генерируются ионы, времяпролетный анализатор размещают под прямым углом к другим элементам ионной оптики (рис.). Рис. 3. Конструкция масс-спектрометра API-TOF.Ионы, образующиеся в источнике, фокусируются в сфокусированный пучок, который направляется путем приложения потенциала к TOF-анализатору под прямым углом. Используя такое решение, можно более точно измерять время пролета ионов в анализаторе, поскольку скорость ионов по оси ионного источника не влияет на время пролета через времяпролетный анализатор. Современный времяпролетный анализатор позволяет получать спектры с высоким спектральным разрешением и измерять отношение массы к заряду с точностью до нескольких частей на миллион и обеспечивает высокую чувствительность.
Ионная ловушка также работает периодически. В течение некоторого времени он улавливает образующиеся в источнике ионы, а затем выборочно опорожняется, т.е. из него последовательно удаляются ионы с заданным отношением массы к заряду. Ионная ловушка также позволяет выполнять фрагментацию. После того, как все ионы в источнике были захвачены, его выборочно откачивают, удаляя все ионы, кроме тех, у которых отношение массы к заряду выбрано для фрагментации. Затем оставшиеся в ловушке заряженные частицы возбуждаются радиочастотными волнами, давление в ловушке повышается и происходит фрагментация, т.е. распад испытуемых ионов на нейтральные частицы и ионы.Последним шагом является выборочное опорожнение ловушки и сбор спектра осколочных ионов. Этот процесс можно повторять много раз. Возможность проведения дальнейшей фрагментации зависит от начального количества ионов и эффективности фрагментации. Ионная ловушка обеспечивает высокую чувствительность как в режиме сканирования, так и в режиме реакции фрагментации. Однако работа ионной ловушки зависит от количества ионов, образующихся в источнике. Чем больше различных веществ ионизировано, тем проще перезарядить ловушку, а значит, измерения в сложных матрицах мало воспроизводимы.Масс-анализатор с преобразованием Фурье высокого разрешения - это еще один тип, используемый в коммерческих масс-спектрометрах (Orbitrap, FTICR-MS). Это пакетный анализатор. Это очень сложный тип масс-анализатора, его работа в очень упрощенном виде выглядит следующим образом. Ионы улавливаются ловушкой специальной конструкции. Для движущихся ионов регистрируется волновая функция, из которой с помощью преобразования Фурье получается спектр масс.Для этих типов анализаторов характерна возможность получения спектра очень высокого разрешения. Однако это происходит за счет сбора спектра. Чем дольше время сбора, тем лучше возможно разрешение. ТИПЫ ТАНДЕМНЫХ МАСС-СПЕКТРОМЕТРОВ В тандемном масс-спектрометре имеется два масс-анализатора и камера столкновений. Это позволяет проводить как МС, так и МС/МС измерения. В настоящее время на рынке доступно множество различных спектрометров, позволяющих работать в режиме МС/МС.Наиболее важные из них: - Спектрометры высокого разрешения (типы QqTOF, Orbitrap, Q-Exactive) Имеются также масс-спектрометры с одним масс-анализатором, но из-за малых возможностей их применения в данной статье они описываться не будут.Тройной квадруполь
В случае тройного квадруполя два квадрупольных масс-анализатора разделены камерой столкновений. Камера столкновений может иметь различную конструкцию. В первых спектрометрах этого типа он также был квадрупольным, отсюда и название этого типа спектрометров.Оба масс-анализатора могут работать в двух режимах, как в режиме сканирования, так и в режиме пропускания выбранных ионов. Он дает множество возможных режимов работы всей системы.Сканирование используется для захвата спектра для определенного диапазона масс. Он используется в качественном анализе, когда мы хотим измерить то, что находится в образце. Современные квадрупольные анализаторы могут сканировать с высокой скоростью, даже до десятков тысяч дальтон в секунду. Однако независимо от того, насколько быстро квадруполь может сканировать, из-за его низкой чувствительности режим сканирования полезен для тестирования в очень простых матрицах и для аналитов с относительно высокими концентрациями для масс-спектрометрии.
То же самое относится и к характеристикам спектров фрагментации МС/МС, когда мы хотим идентифицировать соединения. В режиме сканирования первый квадруполь работает с высокой эффективностью, отбирая ионы с определенным значением m/z. В камере столкновения происходит высокоэнергетическая и эффективная фрагментация. Второй анализатор работает в сканирующем режиме, что сильно снижает чувствительность всего процесса. Тандемный режим работы, в котором тройной квадруполь работает наиболее эффективно, заключается в наблюдении за избранными реакциями фрагментации (MRM/SRM – Multiple/Selected Reaction Monitoring).В первом квадруполе непрерывно отбираются ионы с определенным значением m/z. В камере столкновений происходит высокоэнергетическая и эффективная фрагментация, а второй квадрупольный анализатор пропускает только осколки с определенным значением m/z. Такая конфигурация обоих анализаторов имеет два основных преимущества. Во-первых, он позволяет распознавать анализируемый аналит на основе реакций фрагментации, что значительно повышает селективность измерения. Кроме того, оба масс-анализатора работают непрерывно и фильтруют ионы с максимальной эффективностью.Это очень важно при работе со сложными матрицами. Независимо от того, сколько ионов образуется в источнике, тест-ионы проходят через него с максимальной эффективностью, что позволяет проводить высоковоспроизводимые измерения при низких концентрациях аналита даже со сложными матрицами. В случае, когда масс-спектрометр, работающий в режиме МРМ, подключен к системе ВЭЖХ, в ходе анализа получается график зависимости интенсивности исследуемой реакции фрагментации от времени. При попадании испытуемого вещества в спектрометр интенсивность сигнала тестируемой реакции фрагментации увеличивается и его величина пропорциональна концентрации испытуемого вещества.Это позволяет проводить количественные измерения. Из-за высокой эффективности передачи ионов интенсивность сигнала высока, а уровень шума низкий из-за высокой селективности. В режиме MRM можно получить наилучшее отношение сигнал/шум (S/N – сигнал/шум) на заданном спектрометре, таким образом получив наилучшие пределы обнаружения и количественного анализа (LOD – предел обнаружения и LOQ – предел количественного анализа). . Это лучший режим для проведения количественных измерений. В большинстве рутинных количественных методов в режиме MRM используются стандарты, меченные стабильными изотопами, чтобы обеспечить максимально возможную воспроизводимость измерений.Это соединения с химическими свойствами, практически идентичными исследуемому веществу, однако из-за использования изотопов их масса различна. Поэтому можно отслеживать их концентрацию с помощью другого перехода MRM. Стандарты изотопов добавляют в начале пробоподготовки. Благодаря этому они исключают ошибки, связанные с разным извлечением аналита в процессе пробоподготовки и изменчивостью эффективности ионизации соединений в ионном источнике. Тройной квадруполь имеет еще два уникальных режима сканирования.Это наблюдение за потерей нейтральных частиц (сканирование потери нейтрали) и наблюдение за родительскими ионами (сканирование ионов-предшественников). Они используются для поиска групп соединений, которые либо теряют характерную нейтральную молекулу, либо в которых в результате фрагментации образуется характерный фрагмент. В обеих ситуациях мы получаем значение m/z родительского иона в результате измерения. В этих режимах выполняется сканирование одного или обоих квадруполей, поэтому они обеспечивают высокоселективные измерения, но с низкой чувствительностью.Наблюдение за родительскими ионами когда-то было очень популярно при скрининге новорожденных (NBS). С развитием тройных квадруполей и появлением камер быстрых столкновений эти тесты теперь выполняются в режиме MRM. Это обеспечивает лучшее качество сигнала и, благодаря более высокой чувствительности, позволяет работать с меньшим количеством материала.Ионная ловушка
Ионная ловушка не является тандемным масс-спектрометром. Он имеет только один масс-анализатор, однако, как описано ранее, может собирать как МС, так и МС/МС-спектры.Таким образом, вы можете производить аналогичные измерения, как и при использовании тандемных систем. Этот тип спектрометра характеризуется высокой сканирующей чувствительностью. Поэтому он подходит для качественного анализа соединений при низких уровнях концентрации. Однако в количественном анализе он не работает. С помощью ионной ловушки можно наблюдать отдельные реакции фрагментации, как на тройных квадрупольных спектрометрах. Ионная ловушка имеет только один масс-анализатор, поэтому процесс совершенно другой.Первым шагом является улавливание всех ионов, образующихся в источнике. Затем ловушка выборочно опорожняется и в ней остаются ионы с определенным значением m/z, которые можно фрагментировать. Этот процесс занимает значительно больше времени, чем в тройном квадруполе. Кроме того, чем сложнее матрица и меньше концентрация анализируемого вещества, тем ниже интенсивность сигнала тестируемого вещества в спектре, а значит, измерения с ионной ловушки менее воспроизводимы.QTRAP
Это тройной квадруполь, в котором другой масс-анализатор может работать как квадруполь или как ионная ловушка.Таким образом, он обладает всеми преимуществами тройного квадруполя. Также доступны специальные режимы сканирования ловушек с высокой чувствительностью. В спектрометрах QTRAP имеется квадрупольный масс-анализатор и камера столкновений перед ионной ловушкой. В результате высокую чувствительность ловушки можно полностью использовать при выполнении спектров МС/МС. Какой бы сложной ни была матрица, ионы для фрагментации отбираются непрерывно и с максимальной эффективностью, а в камере столкновений происходит высокопроизводительная фрагментация.Таким образом, в ионную ловушку попадают только осколки ионов с выбранным значением m/z. Затем с помощью ловушки можно собрать спектр фрагментации или выполнить еще одну фрагментацию. Оба эти процесса могут быть выполнены очень повторяемым образом. Уникальным применением спектрометров QTRAP является возможность использования режима MS3 для количественного анализа. Это режим двойной фрагментации, при котором на первом этапе выбираются родительские ионы, а затем один из полученных фрагментов выбирается для фрагментации.Этот режим, названный MRM3, является даже более избирательным, чем просмотр переходов MRM.Спектрометры высокого разрешения
Спектрометры с орбитальной ловушкой представляют собой комбинацию ионной ловушки с анализатором преобразования Фурье. Они предназначены в основном для качественного анализа и идентификации соединений и практически не используются в количественном анализе. Спектрометры Q-Exactive и QqTOF оснащены квадрупольным масс-анализатором, камерой столкновений и анализатором, позволяющим получать спектр высокого разрешения.Эти спектрометры иногда используются в качественном анализе. Количественный анализ предпринимается на спектрометрах Q-Exactive. При тестировании одиночных соединений используется мониторинг выбранных реакций (SRM), режим, очень похожий на наблюдение тройных квадрупольных MRM-переходов, за исключением того, что второй анализатор работает с высоким разрешением. Однако это происходит за счет скорости сбора данных и эффективности передачи данных.Когда на спектрометре этого типа анализируется множество соединений, используется только режим МС. Квадрупольный анализатор выбирает исходные ионы аналитов, которые попадают в анализатор высокого разрешения без фрагментации. Это дает возможность анализировать многие отношения. Однако режим МС даже при точном измерении массы во многих случаях не обеспечивает достаточной селективности. Большинство спектрометров QqTOF также выполняют количественный анализ только в МС. Исключение составляют спектрометры TripleTOF.Они используют режим MRMHR (MRM высокого разрешения). Как и в случае режима SRM, спектрометры Q-Exactive также наблюдают отдельные реакции фрагментации, используя спектры высокого разрешения. Отличие состоит в том, что благодаря высокой скорости работы времяпролетного анализатора можно наблюдать до 100 аналитов за одну секунду. Спектрометры высокого разрешения относительно дороги как в покупке, так и в эксплуатации. Они также не обеспечивают такой высокой чувствительности, как тройные квадрупольные спектрометры.В настоящее время они не получили широкого применения при количественном анализе в диагностических лабораториях. Для рутинного анализа в диагностических лабораториях чаще всего используются тройные квадрупольные и QTRAP-спектрометры из-за режима работы MRM. Нет более чувствительного режима работы масс-спектрометра, обеспечивающего соответствующую селективность и скорость измерения. Какие особенности важны для этого типа спектрометра и какие параметры следует учитывать при выборе системы ЖХ-МС/МС?Важные параметры масс-спектрометра в режиме работы MRM
В настоящее время диагностические лаборатории обычно тестируют до нескольких десятков различных аналитов за один аналитический цикл.Прежде всего, спектрометр должен обладать достаточной чувствительностью, чтобы можно было определять тестируемый параметр во всем диапазоне существующих концентраций. Чем чувствительнее спектрометр, тем проще подготовить образец. Во многих случаях при наличии подходящего чувствительного спектрометра подготовка образца может быть сведена к депротеинизации, а для уменьшения матричного эффекта образец разбавляют перед введением. В большинстве случаев производители указывают чувствительность спектрометра, указывая отношение сигнал/шум, которое можно получить при инъекции определенного количества резерпина.Этот тест проводят с чистым стандартным раствором. Обратите внимание, что в зависимости от конструкции источника ионов чувствительность и, следовательно, пределы количественного определения фактических образцов в сложных матрицах, таких как сыворотка, могут сильно отличаться от технических характеристик.
Еще одной важной особенностью тройных квадрупольных спектрометров является их быстродействие в режиме MRM. Чем быстрее спектрометр, тем больше аналитов можно определить с большей воспроизводимостью. Скорость спектрометра зависит от времени пребывания ионов в ионной оптике.Это время описывается двумя параметрами. Первый параметр — время ожидания. Это время, потраченное на просмотр перехода MRM, другое — время паузы. Это время между каждым проходом MRM. При создании количественного метода на системе ЖХ-МС/МС мы выбираем как минимум один проход MRM для каждого аналита. Общее время цикла измерения равно сумме времени наблюдения и времени перерыва.
Если общее время цикла слишком велико, существует риск сбора недостаточного количества точек измерения и плохого картирования пиков и, следовательно, низкой воспроизводимости метода (рис. 4). Рис. 4. Картирование пиков в зависимости от частоты сбора данных, количество точек на огибающей пика: А) > 20; Б) 14; В) 8; Г) 5 . Таким образом, кажется, что лучший способ сократить общее время цикла — это сократить время наблюдения и перерыва. В современных тройных квадруполях время наблюдения может быть меньше 1 мс, а время паузы — 1 мс. Чем больше сокращается время наблюдения, тем больше вклад времени паузы во время цикла, что снижает эффективность пропускания ионов.Кроме того, чем дольше мы наблюдаем данный переход MRM, тем больше сигнал усредняется по времени и тем лучше качество сигнала, которое мы получаем (рис. 5). Рис. 5. Зависимость стабильности сигнала от времени задержки: А) 40 мс, Б) 5 мс, в) 1 мс. На практике времена наблюдения менее 5 мс не используются. Для анализа большого количества соединений некоторые производители представили программное обеспечение, позволяющее наблюдать переход MRM для аналита в пределах временного окна ожидаемого времени удерживания, а не на протяжении всего анализа.Это решение значительно упростило создание количественных методов и позволило ускорить разработку методов при тестировании более 10 аналитов. В зависимости от структуры и функциональных групп исследуемые аналиты лучше ионизируются в положительной или отрицательной поляризации. Для получения наилучших параметров анализа можно выполнить два анализа одного образца в разных поляризациях или выполнить один анализ, переключая полярность во время его проведения. Доступные на рынке спектрометры имеют время переключения от нескольких до нескольких сотен миллисекунд.Даже в самых быстрых спектрометрах время переключения поляризации в несколько миллисекунд сравнимо с самым коротким временем наблюдения MRM. Изменение полярности с каждым циклом снижает эффективность пропускания ионов и чувствительность спектрометра. Так что, когда полярность меняется во время одного анализа, программное обеспечение опять-таки чрезвычайно важно. Он должен позволять адаптировать переключение полярности к типу анализируемого вещества и времени его удерживания. Это позволяет минимизировать частоту переключения полярности и максимизировать эффективность масс-анализаторов.Следует также помнить, что во многих случаях для получения оптимальных условий анализа выбирают модификаторы подвижной фазы, поддерживающие ионизацию в данной поляризации. Для анализа положительной полярности к фазе добавляют муравьиную или уксусную кислоту. Однако для облегчения отрицательной поляризации в подвижную фазу можно добавить аммиак или органический амин. Таким образом, при создании метода, в ходе которого меняется полярность, анализ проводится в неоптимальных условиях. Параметр, часто упоминаемый в характеристиках тройного квадруполя, — это скорость сканирования.В режиме MRM оба масс-анализатора работают в режиме наблюдения выбранных ионов, поэтому при количественном анализе этот параметр не имеет значения. Кроме того, поскольку сканирование на квадрупольном анализаторе очень неэффективно и поэтому используется редко, значение этого параметра не означает возможности использования тройных квадруполей. Очень важной особенностью системы ЖХ-МС/МС для рутинных анализов в диагностической лаборатории является стабильность работы спектрометра и связанная с этим повторяемость результатов.В спецификациях спектрометров нет параметра, непосредственно его описывающего. Это зависит от многих факторов. Наиболее важной является устойчивость масс-спектрометра к загрязнениям, от которой зависит периодичность очистки ионной оптики и конструкции источника ионов и его устойчивость к матричному эффекту. Разумеется, спектрометр сопряжен с жидкостным хроматографом, поэтому оптимизация условий хроматографии и правильная подготовка пробы способствуют безотказной работе всей системы. Также следует помнить, что чем чувствительнее спектрометр, тем больше ионов попадает внутрь него и тем важнее использовать сверхчистые растворители и заботиться об окружающей среде спектрометра.Поэтому, несмотря на то, что более чувствительный спектрометр дает большие аналитические возможности и зачастую позволяет упростить подготовку пробы к анализу, он не всегда является лучшим решением для лаборатории, выполняющей рутинные диагностические анализы.Наиболее популярные применения ЖХ-МС/МС в лабораторной диагностике
Метод ЖХ-МС/МС используется во многих диагностических лабораториях для определения различных параметров. Его самым большим преимуществом является возможность определения нескольких параметров в ходе одного анализа, низкая стоимость одного анализа и возможность добавления новых аналитов.Недостатком, однако, является высокая стоимость оборудования и необходимость экспертных знаний для эффективного использования возможностей методики ЖХ-МС/МС. Таким образом, жидкостная хроматография в сочетании с масс-спектрометрией обычно используется только в некоторых методах, описанных ниже. Они настолько популярны, что существуют коммерчески доступные наборы реагентов для облегчения измерений.Таблица 1. Использование ЖХ-МС/МС в медицинской диагностике.
Неонатальный скрининг
Одним из самых популярных применений ЖХ-МС/МС в лабораторной диагностике является неонатальный скрининг врожденных метаболических дефектов.В этом случае использование проточно-инжекционного анализа (ППИ) позволяет одновременно определять профиль аминокислот и ацилкарнитинов без необходимости их предварительного разделения на аналитической колонке. Это позволяет использовать очень короткое время анализа (в зависимости от конфигурации системы, даже менее 1 минуты), несмотря на то, что контролируется концентрация нескольких десятков параметров. Поскольку все аналиты и матрица поступают в ионный источник одновременно, возникает матричный эффект, в разной степени нарушающий ионизацию в ионном источнике.Чтобы иметь возможность выполнять измерения с достаточной воспроизводимостью для большинства аналитов, используются стандарты с радиоактивной меткой. Использование метода МС/МС при скрининге также связано с тем, что для проведения теста требуется очень небольшое количество образца. Используется пятно сухой крови (DBS - Dry Blood Spot). На третий-четвертый день жизни у новорожденного ребенка берут из пятки около 30 - 50 л крови (несколько капель) на специальную промокательную бумагу, которую после высыхания отправляют в лабораторию, где проводятся специализированные анализы. выполненный.Тесты должны быть выполнены в течение одной недели после рождения ребенка. Метод МС/МС приобрел популярность благодаря возможности определения параметров по множеству врожденных пороков одновременно. Наиболее частым заболеванием, выявляемым этим методом, является фенилкетонурия, при которой измеряют концентрацию фенилаланина и тирозина. В Польше частота его возникновения составляет около 1 на 8000 рожденных детей. Анализ дополнительных аналитов в образце лишь незначительно увеличивает стоимость измерения, поэтому можно проводить скрининг даже очень редких дефектов.В настоящее время в это исследование включены все дети в Польше. Это скрининговый тест, и родители информируются о результате только в том случае, если он неверен.Контролируемая терапия
В большинстве случаев доза препарата для пациента подбирается исходя из его веса, пола и возраста. Метаболизм активных веществ может сильно варьироваться от человека к человеку. Это приводит к разным концентрациям активного вещества и его активных метаболитов в крови и, таким образом, далекому от оптимального эффекта вводимого препарата.Это особенно важно, например, в случае введения иммунодепрессантов после трансплантации. Слишком низкая доза может вызвать отторжение трансплантата, а слишком высокая доза может разрушить иммунную систему пациента и в конечном итоге привести к его смерти. В настоящее время применяют 4 действующих вещества: Циклоспорин А, Эверолимус, Сиролимус и Такролимус. Методика ЖХ-МС/МС обеспечивает высочайшую селективность (т.е. отсутствие интерференции, что является самой большой проблемой в методах иммуноферментного анализа), необходимую чувствительность и короткое время анализа. Для определения всех веществ используется один метод ЖХ-МС/МС , при котором время анализа составляет менее 5 минут.Мониторинговая терапия и определение концентрации активного вещества с помощью ЖХ-МС/МС все чаще используются также в случае противовирусных, противоопухолевых препаратов и психоактивных веществ.Витамин D
В последнее время очень популярен витамин D. Оказывается, он участвует во многих процессах в организме и влияет не только на процессы, связанные с метаболизмом костной системы и обменом кальция, но и на иммунную систему (в том числе на синтез антибактериальных пептидов), а его дефицит может снижать настроение.В связи со многими важными функциями, которые витамин D выполняет в организме, его предлагается называть гормоном. Поскольку избыток витамина D также может оказывать неблагоприятное воздействие на организм, важно измерять его уровень в организме. Витамин D3 (холекальциферол) образуется в коже под воздействием солнечного излучения, а витамин D2 (эргокальциферол), который обычно добавляют, имеет растительное происхождение. Активной формой витамина D являются его 25-гидроксиметаболиты, то есть 25-ОН-холекальциферол и 25-ОН-эргокальциферол соответственно.В настоящее время большинство определений уровня витаминов проводят с помощью автоматизированных иммуноферментных анализов. В зависимости от производителя они представляют собой общий уровень 25-гидроксиметаболитов или только форму D3. Метод ЖХ-МС/МС считается золотым стандартом. Он обеспечивает высочайшую точность измерений и позволяет определять уровень обеих форм независимо друг от друга. Концентрация метаболитов составляет нг/мл, и это определение может быть выполнено на большинстве доступных тройных квадруполей. Кроме того, исследования последних лет указывают на наличие в организме еще одного метаболита 3-эпи-25-ОН-витамина D3.Это неактивная форма. Определение его уровня особенно важно у детей до 1 года, хотя у взрослых эта форма может составлять даже 17% от общего уровня витамина D. В настоящее время доступны только методы ЖХ-МС/МС, позволяющие проводить рутинную определение этого эпимера. Другим важным метаболитом является 1,25-дигидрокси-витамин D3. Это активный метаболит, образующийся в почках, правильный уровень которого зависит от функционирования этого органа. Его концентрация примерно в 1000 раз ниже концентрации вышеупомянутых метаболитов и находится на уровне нескольких десятков пг/мл.Однако определение этого параметра возможно в основном с использованием наиболее чувствительных систем ЖХ-МС/МС, доступных на сегодняшний день.Токсикология
В токсикологии ставится цель выяснить, каким веществом отравился больной. Важно не сделать точный количественный анализ, а выяснить, какие токсические вещества присутствуют в организме. Измерения можно проводить на различных типах спектрометров. С помощью тройного квадруполя, работающего в режиме MRM, можно тестировать образцы на несколько сотен (около 300) различных ожидаемых веществ (MTS — Multi Target Screening).Такие измерения очень чувствительны, но могут быть обнаружены только контролируемые вещества. Если испытуемый отравился веществом, для которого не определен переход MRM, в этом режиме работы его не обнаружат. Поэтому идентификация только по переходу MRM или даже по нескольким проходам может привести к ложноположительным результатам. С другой стороны, спектрометры, характеризующиеся высокой чувствительностью в режиме сканирования (ионная ловушка, QTRAP), могут быть использованы для проверки присутствия неожиданных веществ (GUS - General Unknown Screening).Для того, чтобы иметь возможность идентифицировать вещества, необходимо создать спектр фрагментации и подтвердить идентичность вещества сравнением со спектром из библиотеки. Ограничением использования этого метода является необходимость наличия соответствующим образом развитой библиотеки спектров и его меньшая чувствительность, значительно хуже, чем в случае тройного квадрупольного режима МРМ. Это особенно важно для малоэффективных ионизирующих веществ. Если найденного вещества нет в библиотеке, его идентификация с помощью масс-спектрометра требует экспертных знаний и не всегда возможна.На спектрометрах QTRAP можно комбинировать МТС и ГУС. В режиме MRM за переходами MRM следует список веществ, для которых требуется высокая чувствительность, а затем в том же цикле выполняется полное сканирование, чтобы увидеть, какие еще вещества могут присутствовать в тестируемом образце. Кроме того, в случае нахождения вещества с помощью перехода MRM возможно выполнение спектров фрагментации с высокой чувствительностью, что позволяет с высокой достоверностью подтвердить идентичность испытуемого вещества.Столь же высокую достоверность полученных результатов можно получить, выполняя измерения на тандемных спектрометрах высокого разрешения. Спектр высокого разрешения используется в качестве начального сканирования, а затем идентичность соединения подтверждается спектром фрагментации. Чувствительность таких измерений ниже, чем в режиме MRM, но кроме того, получается точная масса соединений, что может облегчить идентификацию веществ, которых нет в вашей библиотеке.Будущее масс-спектрометрии в лабораторной диагностике
Святой Грааль ЖХ-МС/МС в диагностике — это полностью автоматизированный анализатор, в который будут вставлены образцы, реагенты и любые расходные материалы, и который после нажатия команды «старт» быстро выдаст информацию по выбранным параметрам во многих образцах.До такого решения еще далеко и пока что для правильной работы системы необходим опытный оператор. В настоящее время ведутся работы по упрощению и ускорению анализа при обеспечении соответствующей чувствительности и специфичности. Самый простой способ ускорить анализ — убрать из системы хроматографическую колонку, как в случае инжекционного анализа. К сожалению, это решение увеличивает матричный эффект в источнике ионов и препятствует определению изобарных соединений.Чтобы уменьшить этот эффект, следует использовать более эффективные методы пробоподготовки. Однако для определения изобарических соединений без применения хроматографии и для сохранения специфичности метода можно использовать спектрометрию ионной подвижности (IMS). В этом методе ионы разделяются не на основе отношения их массы к заряду, а на основе их поперечного сечения, то есть формы молекулы. Все больше и больше компаний внедряют такие решения в серийно выпускаемые масс-спектрометры.Сокращение времени анализа может быть достигнуто за счет использования новых методов ионизации пробы, таких как, например, лазерная диодная термодесорбция (LDTD) в сочетании с ионизацией APCI. Подготовленный образец объемом несколько микролитров помещают на специальный многолуночный планшет с металлическим дном. Лазерный луч, попадая на дно лунки, вызывает термическую десорбцию молекул анализируемого вещества, которые затем ионизируются в коронном разряде. При использовании этого метода время анализа одного образца составляет менее 10 секунд.Еще один способ сократить время анализа пробы — совместить подготовку пробы с измерением. Одним из решений является использование метода ионизации Paper Spray. Механизм ионизации подобен механизму электрораспыления. Измеренный объем крови наносится на хроматографическую бумагу специальной формы. После сушки бумагу смачивают органическим растворителем, помещают перед входным отверстием масс-спектрометра и подают высокое напряжение. Под действием высокого напряжения с кончика бумаги вылетает струя, что обеспечивает ионизацию молекул анализируемого вещества.Реакция системы пропорциональна концентрации аналита. В настоящее время ведутся исследования возможности использования этого метода в рутинном анализе. Его преимущества включают скорость и простоту отбора проб и транспортировки. Задача по-прежнему состоит в том, чтобы получить соответствующую воспроизводимость измерений. В дополнение к изменениям в самой методике измерения также увеличивается количество новых параметров, определяемых методом ЖХ-МС/МС. Наибольшее развитие наблюдается в количественном определении белковых биомаркеров и в метаболомике.В случае определения белка с помощью масс-спектрометра измерение проводят после ферментативного гидролиза (обычно с трипсином). Выбранный пептид с характерной для белка последовательностью определяют в режиме MRM или MRM3. Работа на уровне пептидов определенно повышает чувствительность измерения и его воспроизводимость. Кроме того, это облегчает разработку хроматографического метода.В метаболомическом подходе многие параметры определяются одновременно во время одного измерения. Это аналиты, характерные для выбранного метаболического цикла.В этом типе определений важнее всего не абсолютное значение концентраций, а профиль испытуемых соединений и их соотношение между концентрациями. Для обработки результатов необходимы хемометрические инструменты, позволяющие поставить правильный диагноз.
.90 000Ветеринарная инспекция, Воеводская ветеринарная инспекция в Щецине
ПРЕЙСКУРАНТ ИСПЫТАНИЙ ОТДЕЛА ВЕТЕРИНАРНОЙ ГИГИЕНЫ В ЩЕЦИНЕ.
Л.п.
Типовые испытания
Эббот
Ставка НДС 9000 8
Цена
брутто
1
Взятие материала для приготовления агрегатной пробы:
1.
домашняя птица до двухнедельного возраста
8%
20.00
2.
домашняя птица старше двухнедельного возраста
8%
30.00
3.
яйца, замороженные эмбрионы
8%
20.00
2
Забор материала для исследования от 1 животного:
1.
сбор материала с цыпленка
8%
5.00
2.
поглощение материала (прочие животные) 9000 8
8%
8.00
3
Анатомическая оценка:
1.
органы или срезы
8%
25.00
4
Вскрытие (в стоимость обследования не включена стоимость утилизации п.12.1)
1.
крупные животные - лошадь, корова
8%
150.00
2.
животные среднего размера
8%
75.00
3.
декоративные птицы
8%
50.00
4.
собака, кошка
8%
65.00
5.
птица старше 7 дней 9000 8
8%
10.00
6,
мертвые эмбрионы, цыплята 9000 8
8%
7.00
7.
меховые животные
8%
20.00
8.
комиссионное вскрытие с записью
8%
300.00
9.
рыба (до 5)
8%
15.00
5
Микробиологическое исследование патологического материала:
1.
бактериоскопический тест
8%
15.00
2.
бактериологический тест без лекарственной устойчивости 9000 8
8%
35.00
3.
бактериологическое исследование с идентификацией
и определение лекарственной устойчивости бактерий
8%
60.00
4.
микробиологический тест (бактериологический
и микологический с выявлением и определением лекарственной устойчивости)
8%
80.00
5.
селекционное микологическое исследование (культура
и определение дерматофитов, растительных грибов и др.)
8%
35.00
5,
1.
микологическое исследование (посев с выявлением и определением лекарственной устойчивости) 9000 8
8%
50.00
6.
бактериологическое исследование в модифицированной газовой среде, анаэробных условиях
8%
40.00
7.
обнаружение штрихов Salmonella
8%
30.00
8.
идентификация штамма Salmonella
8%
60.00
9.
общее микробное число
8%
25.00
10
определение количества грибов (урожайность, дрожжи) 9000 8
8%
25.00
11.
тест на кампилобактер плода
8%
50.00
12.
тест на бруцеллы
8%
50.00
13.
Listeria 9000 8 скрининг
8%
50.00
14.
определение лекарственной устойчивости штамма бактерий,
8%
20.00
15
биохимическая идентификация штамма с помощью теста API, BD
8%
20.00
16.
селекционное микологическое исследование (культура
и определение дерматофитов, растительных грибов и др.)
8%
35.00
17.
исследование животных и продукции аквакультуры (бактериологическое, паразитологическое, идентификационное, антибиотикограмма)
8%
150.00
18.
обследование птицы - до 5 штук (анатомо-патологическое, бактериологическое, микологическое исследование, идентификация, антибиотикограмма)
8%
120.00
19.
обследование сопровождающих птиц до 3-х штук (бактериологическое, микологическое, паразитологическое, идентификационное, антибиотикограмма)
8%
120.00
6
Обследование пчел:
1.
испытание 1 образца расплода
8%
40.00
2.
исследование 1 образца взрослых насекомых
8%
40.00
3.
исследование 1 образца на варроатоз
8%
15.00
4.
обследование на ноземоз
8%
15.00
5.
Американский тест на гнилец
8%
30.00
6,
Европейский тест на гнилец
8%
30.00
7
Исследование спермы:
1.
бактериологическое исследование спермы - качественное
и количественный
8%
40.00
8
Паразитологические тесты:
1.
выявление трихомониаза крупного рогатого скота (в экссудации и сперме) 9000 8
8%
30.00
2.
идентификационный номер
8%
25.00
3.
обнаружение эхинококка
8%
20.00
4.
определение вида и количества паразитов в пищевой рыбе
8%
30.00
5.
микроскопическое исследование соскобов кожи (паразитологическое и микологическое) 9000 8
8%
35.00
6,
Паразитологическое исследование Кау методами флотации или декантации 1 проба
8%
25.00
7.
Паразитологическое исследование Кау методом флотации или декантации 3 пробы
8%
50.00
8.
паразитологическое исследование кау на простейшие (Giardia lamblia, Toxoplasma gondii, Trichomonas, Cryptosporidium) 1 образец
8%
25.00
9.
паразитологическое исследование кау на простейшие (Giardia lamblia, Toxoplasma gondii, Trichomonas, Cryptosporidium) 3 пробы
8%
50.00
10.
исследование мазков из зоба, кишечного содержимого на трихомониаз
8%
25.00
11.
тест на легочные нематоды 1 образец
8%
25.00
12.
тест на легочные нематоды 3 образца
8%
50.00
13.
анализ крови на паразитов (Babesia, Anaplasma, Erlichia) 9000 8
8%
20.00
14.
предпродажное обследование живой рыбы (анатомопатологическое, паразитологическое) 9000 8
8%
80.00
15.
паризитологическое обследование рыб (до 10 шт.) 9000 8
8%
60.00
9
Серологические и вирусологические тесты:
1.
Тестовые методы ELISA:
1.
в сторону ЭББ, ИБР/ИПВ, БВД-МД, РРСС, паратуберкулеза до 50 шт - выявление антител/антигена
в сыворотке крови
8%
15.00
2.
в сторону ЭББ, ИБР/ИПВ, БВД-МД, РРСС, паратуберкулеза выше 50 шт - обнаружение антител/антигенов
в сыворотке крови
8%
11.00
3.
в сторону ЭББ, БВД-МД - проба собрана до 10 шт.- обнаружение антител в сыворотке крови
8%
27.00
4.
к болезни Ауески - обнаружение gE-антител в сыворотке крови
8%
22.00
5.
к ИБР/ИПВ выявление антител gB, gE - молоко (пробы танкового молока/объединенные до 5 шт.)
8%
25.00
2.
тест ELISA на болезни домашней птицы
8%
25.00
3.
ИФА-тест (одна проба/направление)
8%
25.00
4.
тест на болезни домашней птицы до 1 образца (Mycopasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae) методом ИФА
8%
25.00
5.
иммунофлуоресцентный анализ (разное) 9000 8
8%
35.00
6,
тестирование лошадей на остановку сердца по методу AGID
8%
25.00
7.
Тест методов OWD
8%
20.00
8.
испытание методов OWD для лошадей
8%
40.00
9.
кислотная агглютинация (ОКАП), агглютинация (МГ, СПГ)
8%
3,00
10.
Агглютинация в пробирке (ОА) 9000 8
8%
15.00
11.
Тест VHS ELISA (объединенный образец)
8%
250.00
12.
ELISA-тест на AL (объединенный образец)
8%
250.00
13.
Тест IHN ELISA (объединенный образец)
8%
150.00
14.
Обнаружение генетического материала методами ПЦР в реальном времени
1.однократный тест - результат до 7 рабочих дней
1.1
Borrelia burgdorferi (болезнь Лайма)
8%
80.00
1,2
Бабезия (Babesia canis, Babesia gibsoni, Babesia divergens)
8%
80.00
1.3
Анаплазма/Эрлихия
8%
80.00
1,4
Вирус клещевого энцефалита (КЭ) 9000 8
8%
100.00
2.однократный тест - экспресс до 24 часов с момента поступления материала в лабораторию
2.1
Borrelia burgdorferi (болезнь Лайма)
8%
160.00
2.2
Бабезия (Babesia canis, Babesia gibsoni, Babesia divergens)
8%
160.00
2,3
Анаплазма/Эрлихия
8%
160.00
2.4
Вирус клещевого энцефалита (КЭ) 9000 8
8%
200.00
3. Базовый пакет
3.1
Borrelia + КЗМ - результат до 7 рабочих дней
8%
180.00
3.2
Borrelia + КЗМ - результат до 24 часов с момента принятия материала на испытания
8%
320.00
4. Расширенный пакет
4.1
Borrelia + KZM + Babesia + Anaplasma/Ehrlichia - результат до 7 рабочих дней
8%
320.00
4.2
Боррелия + КЗМ + Бабезия + Анаплазма/Эрлихия - результат до 24 часов с момента принятия материала на исследование
8%
550.00
5,
выявление генетического материала вируса БВД-МД в коллективных образцах до 30 шт.
8%
100.00
6,
выявление генетического материала отдельных образцов вируса BVD-MD
8%
150.00
7.
выявление генетического материала коллективной пробы вируса ВГС - 10 ед.
8%
70.00
8.
выявление генетического материала коллективного образца вируса ИГН - 10 ед.
8%
70.00
9.
выявление генетического материала коллективной пробы вируса ИПН - 10 ед.
8%
70.00
10.
выявление генетического материала 2 вирусов ВГС + ИГН коллективная проба - 10 шт.
8%
90.00
11.
выявление генетического материала 3-х вирусов ВГС+ИГН+ИПН коллективная проба - 10 шт
8%
130.00
15.
анализ мочи
8%
7.00
16.
микроскопия крови с мазком
8%
12.00
10
Микробиологические и биологические испытания пищевых продуктов и кормов
1.
Количество аэробных микроорганизмов
23%
35.00
2.
Количество урожаев и/или культур:
23%
30.00
3.
Сальмонелла:
1.
обнаружение наличия классического метода селекции
23%
60.00
1.1
обнаружение присутствия в объединенных образцах (например, 5 x 25 г, 5 x 10 г) 9000 8
23%
150.00
2.
обнаружение ПЦР в реальном времени
23%
55.00
2.1
метод ПЦР в реальном времени (минимум 15 образцов одновременно) 9000 8
23%
50.00
2.2
метод ПЦР в реальном времени – объединение образцов (например, 5 x 25 г, 5 x 10 г) 9000 8
23%
120.00
4.
Листерия моноцитогенная:
1.
маркировка номером
23%
70.00
2.
обнаружение наличия классического метода селекции
23%
90.00
2.1
обнаружение присутствия в объединенных образцах (например, 5 x 25 г) 9000 8
23%
180.00
3.
обнаружение ПЦР в реальном времени
23%
85.00
3.1
метод ПЦР в реальном времени (минимум 15 образцов одновременно) 9000 8
23%
75.00
3.2
метод ПЦР в реальном времени – объединение образцов (например, 5 x 25 г, 5 x 10 г) 9000 8
23%
150.00
4.
определение наличия классическим методом или методом ПЦР - гигиенические тампоны
23%
55.00
5,
обнаружение присутствия быстрого метода RAPID
23%
85.00
5.
Campylobacter spp.:
1.
обнаружение присутствия 9000 8
23%
100.00
2.
маркировка номером
23%
100.00
6,
Энтеробактерии:
1.
определение NPL
23%
40.00
2.
определение количества методов испытаний
23%
40.00
7.
Кишечная палочка:
1.
обнаружение присутствия 9000 8
23%
30.00
2.
определение числа пыжковыми методами - Petrifilm E.Coli
23%
40.00
3.
определение количества методов испытаний
23%
35.00
8.
Анаэробные споровые бактерии Клостридиум:
1.
обнаружение присутствия 9000 8
23%
40.00
2.
обнаружение присутствия Clostridium perfringes
23%
40.00
3.
подсчет Clostridium perfringens политениевым методом
23%
50.00
4.
обнаружение присутствия сульфитредуцирующих анаэробных бактерий
23%
40.00
5.
определение присутствия Clostridium botulinum с помощью ПЦР в реальном времени
23%
110.00
9.
Коагулазоположительные стафилококки:
1.
обнаружение присутствия 9000 8
23%
30.00
2.
Определение наиболее вероятного числа (MPN)
23%
35.00
3.
определение количества методов испытаний
23%
40.00
4.
методы определения количества пластин - RPF
23%
50.00
10.
Колиформные бактерии:
1.
обнаружение присутствия 9000 8
23%
30.00
2.
Определение наиболее вероятного числа (MPN) 9000 8
23%
40.00
3.
определение количества методов испытаний
23%
30.00
11.
Площадь туш животных, анализ проб окружающей среды из зоны производства продуктов питания или кормов (количество микроорганизмов и количество Enterobacteriaceae)
23%
30.00
12.
Тестирование проб окружающей среды из зоны производства пищевых продуктов или кормов - (количество: микроорганизмы, Enterobacteriaceae, наличие колиформных бактерий)
23%
55.00
13.
Тестирование проб окружающей среды из зоны производства пищевых продуктов или кормов - (количество: микроорганизмы, сельскохозяйственные культуры и дрожжи, энтеробактерии, наличие колиформных бактерий)
23%
65.00
14.
Количество энтерококков
23%
30.00
15.
Бацилла цереус номер
23%
30.00
16.
Псевдомонада номер
23%
30.00
17
Обработанные биоциды для животных (PAP)
1
Обнаружение и идентификация ПАП - микроскопический метод
23%
90.00
2
выявление и видовая идентификация ДНК биомы животных методом ПЦР в реальном времени.
23%
250.00
18.
Антибиотики:
1.
содержащие антибиотики в лечебных кормах или чистящих смесях
23%
160.00
2.
однородный лечебный корм на основе смеси антибиотика
23%
500.00
3.
обнаружение неразрешенных антибиотиков-стимуляторов роста (например, тилозина) и других активных веществ - скрининг-тест
23%
30.00
19.
1.
Остатки антибиотиков или других антибактериальных веществ в сыром молоке - Delvotest
23%
15.00
2.
Наличие остатков антибиотиков
β-лактам, дигидрострептомицины, стрептомицины, хлорамфеникол и тетрациклины – рецепторный метод – тест 4 SENSOR BSCT
23%
40.00
20.
Количество соматических клеток - микроскопический метод
23%
25.00
21.
Живые вредители в кормах 9000 8
23%
30.00
22.
Ботанические примеси в зерне, семенах 9000 8
23%
30.00
23.
Чисто микробиологическая поверхность с прижимными пластинами (1 шт.)
23%
5.00
24.
Тест термостата - 1 шт
23%
8.00
25.
Образец хранения для одного ассортимента и одного срока хранения
23%
20.00
11
Химические испытания пищевых продуктов животного происхождения и кормов
1.
определение содержания воды (сухого вещества) 9000 8
23%
35.00
2.
определение содержания пучка
23%
60.00
3.
определение сырой клетчатки
23%
70.00
4.
определение золы
23%
35.00
5.
определение нерастворимой в HCl золы
23%
60.00
6,
определение содержания поваренной соли (хлорида натрия) 9000 8
23%
35.00
7.
определение содержания жира по методу Сокслета
23%
65.00
8.
определение содержания жира после гидролиза
23%
85.00
9.
определение летучих оснований аммония
23%
65.00
10.
определение мочевины
23%
85.00
11.
определение содержания нитритов и нитратов
23%
110.00
12.
определение содержания нитритов
23%
80.00
13.
определение гидроксипролина (коллагена) 9000 8
23%
70.00
14.
определение фосфора
23%
65.00
15.
определение содержания добавленного фосфора (п.2 + п.14)
23%
125.00
16.
Определение ткани Ткань (позиция 2 + позиция 13) 9000 8
23%
130.00
17.
определение содержания фтора - питание
23%
70.00
18.
определение общей кислотности
23%
30.00
19.
определение pH
23%
18.00
20.
определение остатков методом ВЭЖХ (малахитовая трава, консерванты и др.)
23%
180.00
21
Определение потребления жира
а также.
определение перекисного числа
23%
50.00
б.
определение кислотного числа
23%
50.00
в.
Экстракция жира для определения Food Index
23%
25.00
22.
определение содержания крахмала
а также.
Определение содержания крахмала в деликатесных продуктах
23%
70.00
б.
Определение содержания крахмала в мясных продуктах
23%
190.00
23
определение элементов: - для каждого
а также.
ФААС-пламенная технология (Cu, Zn, Mg, Ca, Mn, Fe, Na, K)
23%
70.00
б.
ET Метод ААС-графитовой кюветы (Pb, Cd, Se) 9000 8
23%
90.00
в.
HG AAS - Метод генерации гидридов (As, Se)
23%
110.00
д.
ААС-метод амальгамации паров ртути Hg
23%
70.00
е.
ИСП-МС метод масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазменной ионизацией (из 1-2 элементов)
23%
83.00
ф.
ИСП-МС метод масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой - (из 3-4 элементов)
23%
75.00
грамм.
Метод масс-спектрометрии с ИСП-МС
с ионизацией в индуктивно-связанной плазме - (5 и более элементов)
23%
60.00
ч.
Метод масс-спектрометрии с ИСП-МС
с ионизацией в индуктивно-связанной плазме - определение йода (1 проба)
23%
150.00
а также.
Метод масс-спектрометрии с ИСП-МС
с ионизацией в индуктивно-связанной плазме - определение йода (от 2-4 проб)
23%
125.00
дж
Метод масс-спектрометрии с ИСП-МС
с ионизацией в индуктивно-связанной плазме - определение йода (5 и более проб)
23%
115.00
24.
определение остатков пестицидов:
а.
хлорорганические соединения (ГХ-ЭЗД)
23%
210.00
б.
фосфорорганические (ГХ-АФД) 9000 8
23%
250.00
с.
пакет (ЖХ-МС-МС и/или ГХ-МС-МС)
23%
550.00
25.
определение микотоксинов:
а.
Метод ВЭЖХ - на один микотоксин
23%
250.00
б.
Методы ВЭЖХ - на 2-4 микотоксина
23%
235.00
с.
Методы ВЭЖХ - для 5 и выше микотоксинов
23%
220.00
д.
Методы ЖХ-МС-МС - для пакета
23%
600.00
26.
определение содержания кокцидиостатиков:
а также.
никарбазин, лазалоцид, семдурамицин, монензин, наразин, салиномицин - методы ВЭЖХ (цена за один из перечисленных)
23%
175.00
б.
монензин, наразин, салиномицин - за набор
23%
255.00
в.
в нецелевых кормах методами жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС-МС)
23%
550.00
27.
определение содержания гистамина
а также.
Метод ВЭЖХ - определение в 1 образце
23%
250.00
б.
Метод ВЭЖХ - определение в 9 образцах (упаковка)
23%
790.00
28.
определение полициклических ароматических углеводородов ПАУ4 (бенз[а]пирен, бенз[а]антрацен, бензо[b]флуорантен, хризен)
а.
метод газовой хроматографии с детектированием тандемной масс-спектрометрии (ГХ-МС-МС)
23%
485.00
б.
метод жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)
23%
180.00
29.
тест на однородность корма
а также.
определение на основе содержания хлоридов (метод потенциометрического титрования)
23%
210.00
б.
определение по содержанию элементов (метод ФААС)
23%
350.00
12
Утилизация:
1.
утилизация - 1 кг материала
8%
2,50
2.
сипы (упаковка и транспортировка - прогулочные вкладыши, пенопласт, доставка курьером 24 часа) в лабораторию, указанную заказчиком в Польше
23%
85.00
13
Тест на запах для методов травления:
1.
Испытание образца миски для личного пользования на наличие запаха методами травления с применением магнитной мешалки
23%
45.00
14
Заявление о соответствии результатов испытаний:
1.
Заявление о соответствии результата испытаний (для одного метода испытаний) 9000 8
23%
35.00
В случае разового заказа большого количества испытаний или заявленного количества образцов на более длительный срок, по требованию Доверителя и после проведения содержательного и финансового анализа цена на испытания может быть договорной