Мазок пцр

Сдать тест ПЦР на коронавирус Covid-19 в Москве

Метод определения

ПЦР с детекцией в режиме реального времени.

Тест-система «Вектор-Бест», Россия.

Определение РНК вируса SARS-CoV-2 (все виды известных штаммов, включая Дельта, Омикрон и его вариант «Стелс-омикрон»)

Исследуемый материал Мазок со слизистой носоглотки и/или ротоглотки

Для проведения исследования в медицинских офисах Москвы необходимо предъявить СНИЛС и документ удостоверяющий личность.

В случае получения положительного или сомнительного результата на COVID-19 и при необходимости проведения подтверждающего тестирования образец биоматериала может быть направлен в уполномоченную референс-лабораторию в соответствии с СП 3.1.3597-20, в связи с чем установленный срок выполнения исследования может быть увеличен.

Синонимы: Ковид-19; Новая коронавирусная инфекция; РНК нового коронавируса; РНК SARS-CoV-2 в мазке со слизистой носоглотки и/или ротоглотки.  

Comprehensive laboratory diagnosis of coronavirus COVID-19; New Coronavirus RNA in nasopharyngeal and/or oropharyngeal smear.

Краткая информация об инфекции, вызываемой вирусом SARS-CoV-2 (COVID-19) 

SARS-CoV-2 относится к большому семейству РНК-содержащих вирусов – коронавирусов (лат. Coronaviridae), вызывающих респираторные заболевания. В настоящее время известно о циркуляции среди населения четырех видов коронавирусов (HCoV-229E, -OC43, -NL63 и -HKU1), которые круглогодично присутствуют в структуре ОРВИ и, как правило, вызывают поражение верхних дыхательных путей легкой и средней тяжести. К семейству коронавирусов также относятся опасные вирусы SARS-CoV и MERS-CoV, вызывающие тяжелый острый респираторный синдром и ближневосточный респираторный синдром, соответственно. 

Основным источником при инфицировании вирусом SARS-CoV-2 является больной человек, в том числе находящийся в инкубационном периоде заболевания. В настоящее время считается, что инфекция передается воздушно-капельным (при кашле, чихании, разговоре), воздушно-пылевым и контактным путями. При этом факторами передачи могут быть воздух, пищевые продукты и предметы обихода, контаминированные SARS-CoV-2. 

Инкубационный период составляет от 2 до 14 суток. 

У большинства людей (до 80% случаев) инфекция протекает бессимптомно или в легкой форме, у 10-15% – в среднетяжелой форме, крайне тяжелое течение отмечается у 2-5% инфицированных. 

Диагноз заболевания, которому присвоено название COVID-19 и причиной которого является вирус SARS-CoV-2, устанавливается на основании клинического обследования, данных эпидемиологического анамнеза и результатов лабораторных исследований. 

Для заболевания характерно наличие клинических проявлений острой респираторной вирусной инфекции. Основными симптомами являются повышение температуры, кашель сухой или с небольшим количеством мокроты, одышка, миалгия и утомление, ощущение заложенности в грудной клетке. На раннем этапе заболевания COVID-19 возможны диарея, тошнота, рвота. Различают легкую, среднюю и тяжелую формы инфекции SARS-CoV-2. Тяжелая форма заболевания протекает как пневмония с острой дыхательной недостаточностью, острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС), сепсис. 

Тестирование методом ПЦР в режиме реального времени применяют для специфической лабораторной диагностики, подтверждающей инфекцию SARS-CoV-2.

Аналитические характеристики теста ПЦР на «Коронавирус SARS-CoV-2, определение РНК, кач., в мазке со слизистой носоглотки и/или ротоглотки» 

Аналитическая чувствительность 

1×10³ копий/мл исходного образца. 

Аналитическая специфичность 

Перекрестных реакций с вирусами (грипп А и В, парагрипп, аденовирусная инфекция, респираторно-синцитиальная инфекция, метапневмовирусная инфекция, риновирусная инфекция и коронавирусная инфекция человека, вызванная HCoV-NL63, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-HKU1) и микроорганизмами (Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus ) не обнаружено.

Экспресс-тест, ПЦР, РНК вируса SARS-CoV-2, мазок (PCR Rapid test, SARS-CoV-2, RNA, nasopharyngeal and oropharyngeal smear)

Метод определения Технология GeneXpert, ПЦР в реальном времени (RT-PCR). Качественный экспресс-тест «Xpert Xpress SARS-CoV-2», производства Cepheid.

Определение РНК вируса SARS-CoV-2 (все виды известных штаммов, включая Delta и Omicron)

Исследуемый материал Мазок со слизистой носа, носоглотки и/или ротоглотки

Доступен выезд на дом

Для проведения исследования в медицинских офисах необходимо предъявить СНИЛС и документ удостоверяющий личность.

Синонимы: Ковид-19; Новая коронавирусная инфекция; РНК нового коронавируса; РНК SARS-CoV-2 в мазке со слизистой носа, носоглотки и/или ротоглотки. 

Comprehensive laboratory diagnosis of coronavirus COVID-19; New Coronavirus RNA in nose, nasopharyngeal and/or oropharyngeal smear; Coronavirus SARS-CoV-2 RNA detection, qualitative, in nasopharyngeal and/or oropharyngeal smear.  

Краткая информация об инфекции, вызываемой вирусом SARS-CoV-2 (COVID-19) 

SARS-CoV-2 относится к большому семейству РНК-содержащих вирусов – коронавирусов (лат. Coronaviridae), вызывающих респираторные заболевания. В настоящее время известно о циркуляции среди населения четырех видов коронавирусов (HCoV-229E, -OC43, -NL63 и -HKU1), которые круглогодично присутствуют в структуре ОРВИ и, как правило, вызывают поражение верхних дыхательных путей легкой и средней тяжести. К семейству коронавирусов также относятся опасные вирусы SARS-CoV и MERS-CoV, вызывающие тяжелый острый респираторный синдром и ближневосточный респираторный синдром, соответственно. 

Основным источником при инфицировании вирусом SARS-CoV-2 является больной человек, в том числе находящийся в инкубационном периоде заболевания. В настоящее время считается, что инфекция передается воздушно-капельным (при кашле, чихании, разговоре), воздушно-пылевым и контактным путями. При этом факторами передачи могут быть воздух, пищевые продукты и предметы обихода, контаминированные SARS-CoV-2.

Инкубационный период составляет от 2 до 14 суток. 

У большинства людей (до 80% случаев) инфекция протекает бессимптомно или в легкой форме, у 10-15% – в среднетяжелой форме, крайне тяжелое течение отмечается у 2-5% инфицированных. 

Диагноз заболевания, которому присвоено название COVID-19 и причиной которого является вирус SARS-CoV-2, устанавливается на основании клинического обследования, данных эпидемиологического анамнеза и результатов лабораторных исследований. 

Для заболевания характерно наличие клинических проявлений острой респираторной вирусной инфекции. Основными симптомами являются повышение температуры, кашель сухой или с небольшим количеством мокроты, одышка, миалгия и утомление, ощущение заложенности в грудной клетке. На раннем этапе заболевания COVID-19 возможны диарея, тошнота, рвота. Различают легкую, среднюю и тяжелую формы инфекции SARS-CoV-2. Тяжелая форма заболевания протекает как пневмония с острой дыхательной недостаточностью, острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС), сепсис.  

Тестирование методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени применяют для специфической лабораторной диагностики, подтверждающей инфекцию SARS-CoV-2. 

Аналитические характеристики теста «Экспресс-тест, ПЦР, РНК вируса SARS-CoV-2, мазок» 

Аналитическая чувствительность 

Аналитическая чувствительность: 250 копий/мл исходного образца. 

Аналитическая специфичность 

 На основании компьютерного анализа возможных перекрестных реакций не ожидается непреднамеренной перекрестной реактивности с микроорганизмами: Коронавирусы человека (229E, OC43, HKU1, NL63, SARS, MERS), Аденовирус (например, C1 Ad. 71), Метапневмовирус человека (hMPV), Вирус парагриппа тип 1-4, Вирусы гриппа (А, В, С), Коронавирус летучих мышей Enterovirus (например, EV68), Респираторно-синцитиальный вирус, Rhinovirus, Chlamydophila pneumoniae, Haemophilus influenza, Legionella pneumophila, Mycobacterium tuberculosis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Bordetella pertussis, Mycoplasma pneumoniae, Pneumocystis jirovecii (PJP), Parechovirus, Candida albicans, Corynebacterium diphtheria, Legionella pneumophila, Bacillus anthracis (сибирская язва), Moraxella catarrhalis, Neisseria elongata и meningitides, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus salivarius, Leptospira, Chlamydophila psittaci, Coxiella burnetii (ку-лихорадка), Staphylococcus aureus.  

С какой целью выполняют исследование «Экспресс-тест, ПЦР, РНК вируса SARS-CoV-2, мазок» 

Тест проводят с целью определения наличия РНК коронавируса SARS-CoV-2 в мазке со слизистой носа, носоглотки и ротоглотки методом ПЦР с детекцией в режиме реального времени (RT-PCR).

Устранение неполадок в вашем PCR

Что делать, если ваш PCR дает сбой? Приведенные ниже часто задаваемые вопросы помогут вам на пути к успешной ПЦР.

Чтобы получить советы о том, как спасти свои эксперименты от заражения ПЦР, ознакомьтесь с этой статьей в блоге.

Если продукты амплификации не получены, какие параметры следует учитывать в первую очередь при устранении неполадок?

Примите во внимание следующее:

• Во-первых, убедитесь, что все компоненты ПЦР включены в реакцию. Положительный контроль всегда должен быть включен, чтобы убедиться, что каждый компонент присутствует и функционирует.
• Если проблем с экспериментальной установкой не возникло, увеличьте количество циклов ПЦР (3–5 циклов за раз) до 40 циклов. Увеличение числа циклов может решить проблемы с малочисленностью матрицы или недоступностью матрицы из-за примесей в праймерах или их низкой эффективности праймирования.
• Если увеличение числа циклов не улучшает результаты, возможно, условия ПЦР слишком строгие для определенного набора праймеров или шаблона. Рассмотрите возможность изменения условий ПЦР следующим образом:
  • Уменьшайте температуру отжига с шагом в 2 градуса.
  • Увеличьте время расширения.
  • Увеличьте количество шаблонов. Обратитесь к рекомендациям, прилагаемым к ферменту, чтобы определить оптимальное количество шаблона.

Рассмотрите следующие дополнительные возможные причины неудачи ПЦР:

• Ингибиторы ПЦР в образце матрицы
  Если ингибиторы ПЦР присутствуют, использование разбавленной матрицы может повысить эффективность ПЦР. В качестве альтернативы может потребоваться очистка шаблона с использованием набора, такого как гель NucleoSpin и набор для очистки ПЦР. Если очистка матрицы невозможна, улучшить результаты может фермент с более высокой устойчивостью к примесям, такой как полимераза Terra PCR Direct.

• Матрица содержит >65% GC
  При амплификации на матрицах с высоким содержанием GC используйте фермент, разработанный для этих условий. Посетите наше руководство по выбору ПЦР, чтобы найти подходящий фермент.

• Неоптимальные праймеры
  Внимательно проверьте свои праймеры; переоформление при необходимости. Также рассмотрите возможность повторной амплификации первичного продукта ПЦР с использованием 10-кратных разведений (от 1:100 до 1:10 000) с использованием вложенных праймеров.

При использовании ДНК-полимеразы PrimeSTAR HS учитывайте:

• Использование соответствующего количества шаблона. Если шаблон представляет собой геномную ДНК человека или библиотеку кДНК, используйте не более ~ 100 нг шаблона в реакционной смеси объемом 50 мкл.
• Использование времени расширения не менее 1 мин/кб.
• Увеличение концентрации праймеров.

При использовании ДНК-полимеразы PrimeSTAR Max учитывайте:

• Регулировка времени удлинения, если реакционная смесь содержит избыток матрицы. Если количество шаблона превышает 200 нг в реакционной смеси объемом 50 мкл, установите время удлинения от 30 с/кб до 1 мин/кб.
• Увеличение концентрации праймеров.

При использовании ДНК-полимеразы SpeedSTAR HS учитывайте следующее:

• Увеличение времени удлинения. Хотя стандартное время удлинения составляет 10 с/кб, время удлинения может быть увеличено до ~0,5 мин/кб для сложных матриц, таких как геномная ДНК человека.

Если есть неспецифические полосы амплификации, что можно сделать для повышения специфичности?

Все ПЦР-полимеразы Takara Bio

Выпуск:

Праймеры неспецифичны.

Решение:

Используйте выравнивание BLAST, чтобы определить, комплементарны ли 3'-концы праймеров сайтам, отличным от целевых сайтов. При необходимости измените дизайн праймеров или измените условия ПЦР.

Выпуск:

Условия ПЦР недостаточно строгие.

Решения:

• Увеличивайте температуру отжига с шагом 2 градуса.
• Используйте ПЦР приземления.
• Используйте двухэтапный протокол ПЦР.
• Уменьшить количество циклов ПЦР.

Проблема:

Было использовано слишком много шаблона.

Решение:

Уменьшите количество в 2–5 раз.

ДНК-полимеразы PrimeSTAR HS и PrimeSTAR Max

Выпуск:

Время отжига слишком велико.

Решение:

Для достижения специфической амплификации важно использовать короткое время отжига (5–15 с) при проведении трехэтапной ПЦР.

ДНК-полимеразы PrimeSTAR GXL

Выпуск:

Праймеры имеют субоптимальные значения T _m .

Решение:

Для амплификации мишеней <1 т.п.н. разработайте праймеры со значениями T _m >55°C и используйте температуру отжига 60°C. Если значения праймера T _m <55°C, попробуйте уменьшить время удлинения от 5 до 10 сек/кб.

Takara

Выпуск:

Неспецифический отжиг праймеров при низких температурах.

Версии этих ферментов с горячим стартом могут улучшить результаты для некоторых праймеров.

ДНК-полимераза SpeedSTAR HS

Выпуск:

Размазывание полос продукта ПЦР на геле.

Слишком длительное время наращивания может привести к смазыванию. Общая рекомендация по времени удлинения для этого фермента составляет 10–20 с/кб. Если выход ПЦР низкий, попробуйте увеличить количество циклов на 5.

Если ПЦР дает мазок после обработки продуктов на геле, что можно сделать для улучшения результатов?

Сначала определите источник мазка, используя положительные и отрицательные (без шаблона) контроли. Это может определить, является ли причиной мазка загрязнение или чрезмерное циклирование, или является ли мазок результатом плохо разработанных праймеров или неоптимальных условий ПЦР.

Если отрицательный контроль пустой, загрязнения нет. Вместо этого необходимо будет оптимизировать условия ПЦР; при настройке условий ПЦР учитывайте следующее:

• Уменьшить количество шаблонов.
• Увеличьте температуру отжига.
• Используйте ПЦР приземления.
• Уменьшить количество циклов ПЦР.
• Измените дизайн праймеров.
• Используйте вложенные праймеры.
• Повторно усилить продукт. (Небольшую пробку геля можно удалить кончиком микропипетки, а ДНК можно выделить, добавив пробку в 200 мкл воды и затем инкубировав при 37°C. 5 мкл этого раствора можно использовать в качестве ПЦР-матрицы для повторное усиление.)

Если отрицательный контроль также смазан, значит, имеется контаминация. Вам нужно будет определить источник этого загрязнения. Может потребоваться замена реагентов для ПЦР и дезинфекция пипеток и вашей рабочей станции (дополнительную информацию о загрязнении см. в приведенных ниже вопросах).

Каковы некоторые источники загрязнения ПЦР?

Существует четыре основных источника контаминации ПЦР:

1. Наиболее частым источником контаминации является продукт ПЦР от предыдущих амплификации (называемый "переносом контаминации"). При большом количестве продукта ПЦР (10 ¹² молекулы) генерируются многократно в течение определенного периода времени, вероятность загрязнения возрастает.
2. Еще одним источником заражения является клонированная ДНК, ранее обработанная в лаборатории.
3. Также может происходить загрязнение от образца к образцу. Этот источник загрязнения, скорее всего, будет обнаружен в образцах, которые требуют тщательной обработки перед амплификации.
4. Реакции также могут быть загрязнены экзогенной ДНК в окружающей среде, включая ДНК, присутствующую на лабораторном оборудовании и в реагентах, используемых для выделения ДНК и ПЦР.

Как можно избежать загрязнения?

Чувствительность ПЦР требует, чтобы образцы не были загрязнены какой-либо экзогенной ДНК или любыми ранее амплифицированными продуктами из лабораторной среды. Мы рекомендуем использовать отдельные области для подготовки образцов, настройки ПЦР и пост-ПЦР-анализа.

Для приготовления реакционных смесей рекомендуется ламинарный бокс с УФ-лампой. Должны быть установлены две станции, которые физически отделены друг от друга.

• Установите «область перед ПЦР», предназначенную только для настройки реакции ПЦР. Никакие предметы из «зоны после ПЦР» не должны вноситься в эту зону; это включает в себя такие предметы, как блокноты и ручки.
• Создание «пост-ПЦР-области», которая используется для ПЦР, очистки ПЦР-амплифицированной ДНК, измерения концентрации ДНК, работы с агарозными гелями и анализа продуктов ПЦР.

Использование оборудования также должно быть ограничено этими зонами. Аппарат для ПЦР и аппарат для электрофореза должны располагаться в пост-ПЦР-зоне. Настоятельно рекомендуется иметь пипетки и наконечники пипеток с аэрозольными фильтрами, предназначенные только для проб ДНК и приготовления реакционной смеси. Дополнительные рекомендации включают:

• Наличие отдельных наборов пипеток и наконечников для пипеток, лабораторных халатов, перчаточных боксов и мусорных корзин для зон до и после ПЦР.
• Маркировка предметов до и после ПЦР, чтобы они не удалялись из отведенной для них рабочей зоны.
• Следуя золотому правилу ПЦР: НИКОГДА не приносите какие-либо реагенты, оборудование или пипетки, использованные в зоне после ПЦР, обратно в зону перед ПЦР.
• Подготовка и хранение реагентов для ПЦР отдельно и использование их исключительно по назначению. Реагенты должны быть разделены на аликвоты небольшими порциями и храниться в специально отведенных местах в зависимости от того, используются ли они для приложений до ПЦР или после ПЦР. Аликвоты следует хранить отдельно от других образцов ДНК.

Всегда следует проводить контрольную реакцию, в которой отсутствует матричная ДНК, для подтверждения отсутствия контаминации. Кроме того, количество циклов ПЦР должно быть сведено к минимуму, так как высокочувствительные анализы более подвержены воздействию контаминации.

Как я могу обеззаразить, если у меня есть ПЦР-заражение?

1. Оставьте пипетки под УФ-светом в боксе для клеточных культур на ночь. УФ-облучение способствует сшиванию остатков тимидина, повреждая остаточную ДНК.
2. Опрыскайте рабочие места/оборудование/пипетки 10% отбеливателем, а затем протрите насухо.
3. Смена рабочих станций; переместите область предварительной ПЦР в другое предварительно очищенное место.
4. Не используйте инструменты или пипетки, которыми вы пользовались ранее.

Что делать, если PCR выдает ошибки?

Во избежание ошибок при проведении ПЦР мы рекомендуем использовать фермент высокой точности (см. руководство по выбору). Кроме того, обязательно избегайте следующего:

1. Избыточное циклирование
   Избыточное циклирование Реакции ПЦР часто:
   • Изменяет pH реакции таким образом, что это дестабилизирует ДНК.
   • Увеличивает количество продукта ПЦР, тем самым снижая эффективность полимеразы и способствуя ошибкам.
   • Уменьшает количество dNTP, тем самым увеличивая вероятность неправильного включения оснований из-за несбалансированной концентрации dNTP. (При использовании ПЦР-ферментов Takara Bio концентрация dNTP оптимизируется до 200 нМ; повышение концентрации dNTP приводит к неправильному включению.)
   • Вызывает накопление одноцепочечной и двухцепочечной ДНК.
2. High Mg ²⁺  концентрация
   Mg ²⁺  концентрация колеблется от 1–5 мМ. Использование высокой концентрации Mg ²⁺  может увеличить выход, но также может повлиять на корректирующую активность ферментов. Однако концентрация Mg ²⁺ всегда должна быть выше, чем концентрация dNTP.
3. Повреждение матричной ДНК
   Ограничьте время воздействия УФ-излучения при анализе или вырезании продуктов ПЦР из гелей.

Что такое ингибиторы ПЦР?

Примеси, препятствующие амплификации ПЦР, известны как ингибиторы ПЦР. Ингибиторы ПЦР присутствуют в самых разных типах образцов и могут приводить к снижению чувствительности ПЦР или даже к ложноотрицательным результатам ПЦР. Ингибиторы ПЦР могут иметь как неорганическое, так и органическое происхождение (Schrader 2012).

Неорганические ингибиторы ПЦР включают:

• Ионы кальция или других металлов, которые конкурируют с магнием
• ЭДТА, который связывается с магнием, снижая его концентрацию

Некоторые органические ингибиторы ПЦР включают:

• Полисахариды и гликолипиды, имитирующие структуру нуклеиновых кислот, препятствующие связыванию праймеров с матрицей
• Меланин и коллаген, образующие обратимый комплекс с ДНК-полимеразой
• Гуминовые кислоты, взаимодействующие с матричной ДНК и полимеразой, предотвращая ферментативную реакцию даже при низких концентрациях
• Мочевина, которая может привести к деградации полимеразы

Другие органические соединения, которые могут ингибировать ПЦР, включают:

• Гемоглобин, лактоферрин и IgG в образцах крови, сыворотки или плазмы
• Антикоагулянты, такие как гепарин
• Полифенолы, пектин и ксилан из растений
• Этанол, изопропиловый спирт, фенол или моющие средства, такие как SDS

Если в препарате матрицы присутствуют ингибиторы, 100-кратное разведение исходной матрицы может достаточно разбавить ингибитор и сделать возможной амплификацию. В качестве альтернативы для решения проблемы может потребоваться осаждение шаблона этанолом.

Ссылки

Schrader, C., et al. Ингибиторы ПЦР — появление, свойства и удаление. J Appl Microbiol. 113 :1014–1026 (2012).

Что такое перециклирование ПЦР? Как я узнаю, что мой продукт переработан?

Избыточный цикл ПЦР — это когда цикл выходит за пределы экспоненциальной фазы амплификации. Избыточное циклирование происходит, когда во время ПЦР происходят следующие события:

• Истощение субстратов (дНТФ или праймеров).
• Реагенты (дНТФ или ферменты) больше не стабильны при температуре денатурации.
• Продукт ингибирует ПЦР-полимеразу (пирофосфат, дуплексная ДНК).
• Конкуренция за реагенты (дНТФ и праймеры) со стороны неспецифических продуктов.
• Снижение рН реакции.
• Неполная денатурация/разделение нитей продуктов при высоких концентрациях продукта.

Индикатором избыточного цикла ПЦР является интенсивный фоновый мазок с неразличимыми полосами при разрешении реакции на агарозном геле. Всегда рекомендуется проводить предварительный тест для определения минимального количества циклов ПЦР, необходимого для получения достаточного количества продукта. Продукт ПЦР остается в линейной фазе амплификации, если выход продукта заметно увеличивается каждые 3–5 циклов. Мы находим, что избыточный цикл  кДНК не дает подходящей матрицы для любого последующего применения.

Какие типы мутаций могут быть вызваны ПЦР?

ПЦР-полимеразы могут вводить различные типы мутаций, в том числе однонуклеотидные замены, делеции и вставки. Замены оснований обычно вызваны неправильным включением неправильного dNTP во время синтеза ДНК.

Полимеразы могут генерировать мутации в местах, где один или несколько нуклеотидов утрачены или приобретены. Частота этого типа мутаций может зависеть от последовательности и может быть выше в сильно повторяющихся последовательностях. Наиболее распространенной мутацией является потеря одного нуклеотида, которая может быть результатом несоответствия матрицы-праймера в повторяющейся гомополимерной последовательности. Перестройки ДНК также могут происходить, когда полимераза прекращает синтез на одной цепи ДНК и продолжает синтез после того, как происходит праймирование на комплементарной цепи (т. Е. ПЦР с переключением цепей или скачком). Этот тип мутации имеет место, когда существует высокая степень гомологии между различными областями ДНК. Избыточная ДНК-матрица в реакции также может способствовать этому типу мутации.

Какие факторы способствуют мутациям, индуцированным ПЦР?

Следующие факторы могут способствовать мутациям, вызванным ПЦР:

• Несбалансированные концентрации dNTP
  Неравные количества четырех dNTP могут увеличить замену оснований в восемь раз. Использование равных концентраций четырех dNTP имеет решающее значение для снижения частоты ошибок полимеразы.
• Высокая концентрация фермента

• Длительное время инкубации

• Отсутствие 3'→5' экзонуклеазной активности

• Концентрация магния
  Точность самая высокая, когда концентрация Mg ²⁺ эквимолярна общей концентрации dNTP. Точность снижается при увеличении концентрации свободных двухвалентных катионов.

• pH реакции
  Понижение pH реакции на три единицы может увеличить замещение оснований до 60 раз. Низкий рН (<6,0) может привести к спонтанной потере пуринов.

• Повреждение ДНК
  Повреждение ДНК может произойти при высоких температурах, что может увеличить скорость мутаций. Одной из частых мутаций является дезаминирование цитозина с образованием урацила.

• Наличие отрезков А в последовательностях праймеров

• Избыточное количество циклов
  Частота ошибок увеличивается, когда концентрация ДНК увеличивается во время последних циклов ПЦР. Общее количество циклов должно быть сведено к минимуму, чтобы получить желаемый продукт ПЦР без ошибок.

Что такое артефакты ПЦР?

Ниже приведены распространенные артефакты ПЦР:

• Димеры праймеров
  Димеры праймеров образуются за счет самокомплементарности на 3'-конце праймеров для амплификации. Димеры праймеров подозреваются, если продукт получен в реакции без матрицы (отрицательный контроль). Чтобы избежать димеров праймеров, праймеры не должны иметь комплементарность на своих 3'-концах.
• Химерные продукты ПЦР
  Химерные продукты ПЦР могут быть вызваны неполностью расширенной матрицей. Другими словами, одноцепочечная матрица, которая не была полностью реплицирована из-за преждевременной терминации полимеразы, может отжигаться до частично гомологичной матрицы. Это создает химерные продукты ПЦР. Чтобы свести к минимуму химеры, используйте как можно меньше циклов амплификации ПЦР.
• Смещение ПЦР
  Смещение ПЦР возникает, когда некоторые последовательности амплифицируются более эффективно, чем другие из-за преимущественного связывания праймеров ПЦР. Если одна последовательность амплифицируется на 10% больше, чем другая в одном цикле, она будет в 17,4 раза более многочисленной после 30 циклов. Чтобы уменьшить смещение ПЦР, используйте высокую скорость линейного изменения между этапами денатурации и отжига и используйте низкие температуры отжига. Следует избегать длительного времени расширения (> 180 с).
• Дрейф ПЦР
  Дрейф ПЦР возникает из-за стохастических флуктуаций во взаимодействиях реагентов ПЦР, особенно в ранних циклах, когда существует очень низкая концентрация матрицы. Этот артефакт наблюдается в мультиплексных анализах, где потеря чувствительности вызвана взаимодействием между различными наборами праймеров. Важно тщательно разработать праймеры для этих типов анализов.
• ПЦР генерирует высокомолекулярные продукты, которые едва мигрируют через агарозный гель
  У этого артефакта нет хорошего объяснения. Большинство исследователей предполагают, что это вызвано сверхциклированием, поскольку на более поздних стадиях ПЦР накапливаются как одноцепочечные, так и двухцепочечные молекулы. Накопление таких одноцепочечных молекул может создавать гетеродуплексы, конкурируя с праймерами. Неполная денатурация на более поздних стадиях, когда имеется высокая концентрация продуктов ПЦР, препятствует разделению цепей ДНК, и, таким образом, вновь образованный ампликон может остаться связанным с ранее изготовленной матрицей. Этот процесс может повторяться, захватывая продукты ПЦР сетью молекул.

  Другим объяснением происхождения высокомолекулярных мазков является частичное удлинение матриц во время начальных циклов ПЦР. Частичные удлинения могут быть получены за счет артефактов прыжка - когда праймер или одноцепочечная ДНК отжигается и простирается от одного сайта затравки, а затем частично отжигается до гомологичного сегмента в другом месте (см. Продукты химерной ПЦР выше). Частично вытянутые молекулы могут действовать как новые праймеры, поскольку они содержат свободный 3'-ОН, и могут генерировать химерные молекулы, сочетающие начальный сайт праймирования и сайт «прыжка».

  Наконец, этот тип артефакта также может быть создан, когда для ПЦР используется грубая матрица. Продукты, амплифицированные непосредственно из тканей животных или растений, могут попасть в клеточный дебрис, что препятствует их миграции в геле. Эту проблему можно решить путем расщепления амплифицированного продукта ПЦР протеиназой К:

  • Добавьте 15 мкл загрузочного буфера, содержащего протеиназу К, ко всей 50-мкл реакции ПЦР.
  
  ИЛИ
  • Перед загрузкой образцов на гель добавьте 1 мкл буфера для загрузки, содержащего протеиназу К, к 4 мкл реакции ПЦР.