Анализ на чувствительность к антибиотикам и бактериофагам

Ссылки

1. Дзержановска Д., Еляшевич Ю.: Госпитальные инфекции. Wydawnictwo a-medica-press 1999. 2. Dzierżanowska D.: Устойчивые к антибиотикам бактерии в больнице. Новая Медицина 1997; 16: 18-22. 3. Дзержановская Д.: Принципы применения антибиотиков при лечении бактериальных инфекций. Микробиол Мед 2003; 2 (35): 3-14. 4. Hryniewicz W.: Бактериальная резистентность. Инфомедика (онлайн) 1998; 5. 5. Hryniewicz W.: Проблемы антибиотикорезистентности наиболее распространенных внутрибольничных возбудителей.Новая медицина 1998; 2: 23-29. 6. Янец В., Крупиньска Ю.: Фармакодинамика. PZWL 2003. 7. Мальм А. и др.: b-лактамазы, эффективное оружие бактерий в борьбе с b-лактамными антибиотиками. Альмаматер 2004; 4 (45): 158-165. 8. Мальм А. и др.: Лекарственная устойчивость бактерий. Альмаматер 2002; 2 (43): 128-135. 9. Мальм А. и др.: Метициллин-резистентные штаммы золотистого стафилококка. Алмаматер 2003; 3 (44): 64-69. 10. Мазур Е.: Предположения рациональной антибиотикотерапии.Семейная медицина 2002; 2 (18): 89-93. 11. Meszaros J. и др. Септические осложнения, этиология и принципы химиотерапии. Микробиол Мед 2001; 2 (27): 3-8.

Антибиотики в эпоху повышения лекарственной устойчивости

Единственная актуальная книга на польском рынке, в которой всесторонне обсуждается тема антибиотикорезистентности и лекарственной устойчивости, то есть глобальная проблема 21 века - как с точки зрения истории, так и классификации по действию, механизмов резистентности, способов противодействия ей. , а также исследования, направленные на замену антибиотиков.

Книга будет адресована в первую очередь биологам, медикам, натуралистам, а также по тематике загрязнения окружающей среды антибиотиками и продуктами их разложения для студентов факультетов охраны окружающей среды.

Покровители СМИ:

Партнеры:

Антибиотики_82-83.пдф (пдф)

75 КБ

Антибиотики_300-301.pdf (pdf)

74 КБ

Антибиотики_56.pdf (pdf)

52 КБ

Здислав Маркевич

Дорота Корсак

Магдалена Поповска

Читать

Антибиотики_82-83.pdf (pdf)

75 КБ

Антибиотики_300-301.пдф (пдф)

74 КБ

Антибиотики_56.pdf (pdf)

52 КБ

→ Микробиология Антибиотики Краткий обзор → Начать обучение / Скачать карточки в формате MP3

[PDF] Методы обнаружения и идентификации бактерий

Скачать Методы обнаружения и идентификации бактерий...

Структура бактериальной клетки

Микробиологический тест 

Цель: выявление этиологического фактора инфекции и определение чувствительности к антибиотикам



Курс микробиологических исследований 0002 



Классические методы  Микроскопическое исследование  Культура и идентификация микроорганизма  Определение чувствительности бактерий к антибиотикам  Сбор и перенос

2 Молекулярные методы материала Тип транспортной среды и тип контейнеров адаптированы к типу материала и направлению исследования (бактерии, вирусы, наличие антител)

Микроскопическое исследование Световой микроскоп  Окрашенные препараты  Метод Грама  специальные методы, например,окраска на наличие спор 

Clostridium tetani tetanus, споры на конце бактериальной клетки имеют форму палочки шлака

Бактериальная клеточная стенка Грамположительные бактерии

Грамотрицательные бактерии

Микроскопическое исследование

3 Neisseria

Микроскопическое исследование 

Препарат с темным полем зрения (Treponema pallidum)  Флуоресцентный микроскоп

Микроскопическое исследование Контрастное микроскоп фазовый

Candida

электронный

Бактериальные культуры 

Прикладные жидкие и твердые бактериологические среды



Культивирование проводят в условиях, наиболее подходящих для искомых микроорганизмов



Время культивирования li в течение нескольких часов (напр.coliform bacteria, i.e. Escherichia coli) up to several days (e.g. mycobacteria tuberculosis, i.e. Mycobacterium tuberculosis)

Growth requirements of bacteria 

Oxygen demand   



Carbon source 



0003

0003 O2 Анаэробные - менее 1-0,5% O2 Микроаэрофильные - смесь 5% O2, 10% CO2, 85% N2 Автотрофные - CO2 Гетеротрофные - аминокислоты, пептиды, сахара, липиды

Другие соединения, необходимые для роста 



Неорганические соли витаминов

Физико -химические факторы 

Температура   



PH 



Психофилы - Оптимальные 0-10 ° С - оптимальные 20-40 -м.  C Большинство бактерий предпочитают нейтральный pH ~ 7.0

Осмотическое давление 

Наиболее предпочтительные aw ~ 0,99

Рост культуры бактерий в жидкой среде

Посев и идентификация микроорганизмов Агаризованная среда обогащенная кровью - видимая зона гемолиза вокруг колонии

Выращивание микроорганизмов селективно

,

БЛРС

VRE

Культура и идентификация микроорганизмов Идентификация микроорганизмов с помощью тестов, проведенных на

бациллах

Культивирование и идентификация микроорганизмов Идентификация микроорганизмов3 с использованием

наборы пробирок

готовые идентификационные тесты

Автоматические системы Автоматические системы используются для культивирования микроорганизмов (например,Bactec для посева крови) или для идентификации и определения антимикробной чувствительности ранее культивируемых микроорганизмов

VITEK 2 Compact BioMerieux

Phoenix BD Diagnostic Systems

VITEK 2 Compact System Автоматическая система для идентификации и определения антимикробной чувствительности ранее культивированных микроорганизмов

Определение чувствительности к антибиотикам

Определение методом разведения Готовые диагностические тесты для ручного считывания Определение с помощью автоматизированных систем

Определение чувствительности к антибиотикам и механизмов резистентности

) устойчивые ко всем -лактамным антибиотикам (MRSA)

Иммунологические методы 

Латекс, ИФА, гены бактерий (поверхностные белки, капсульные полисахариды, токсины)  Позволяют обнаружить бактерии в материале, взятом от больного, или помогают в идентификации культивируемых бактерий  Используются готовые ручные или автоматические тесты Латексная агглютинация

Иммунологические методы – ИФА

Иммунологические методы – автоматические системы

Система VIDAS

Новые методы, основанные на иммунологических методах

Спектрометрия MALDI-TOF

Спектрометрия MALDI-TOF

Спектрометрия MALDI-TOF

Молекулярные реакции, основанные на реальных коммерческих методах ПЦР - доступны ПЦР-тесты во времени  в двух вариантах  Набор реагентов для обнаружения бактерий, реакции в любом аппарате ПЦР или ПЦР в реальном времениM.tuberculosis и выявление эпидемиологически важных бактерий, например, MRSA или обнаружение бактериальных токсинов )

Метод ПЦР

ДНК

RULER 100 6018/99 6758/99 ATCC43300 ATCC 29213 RULER100

Метод ПЦР

MECA AGRES. время ПЦР-тесты

напр.GeneXpert

Scorpion Probes

Two types of Scorpion probes used in the GeneXpert series

Figures: Cepheid source

Integrated internal control in the reaction mixture

Mg

2+

target scorpion

target scorpion

scorpion

dCTP

dGTP dUTP

Internal Control (IC)

dATP

drawings source Cepheid

Microarrays

Bacteriophages - bacterial viruses

Bacteriophages

Bacteriophages

Bacteriophages

bacteriophages 9000 

Typing bacteria to determine the relationship of изолированные штаммы

налет

Бактериофаги – применение для обнаружения и идентификации бактерий

Бактериофаги – применение для обнаружения и идентификации бактерий

Бактериофаги – применение для обнаружения и идентификации бактериотерапия

Спасибо за внимание

.

[PDF] МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИЙ

1 МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИЙ др н.мед. Дорота Жабицка Кафедра эпидемиологии и клинической микробиологии, Нар ...

Микробиология, то есть изучение микроорганизмов (вирусов, бактерий, простейших, дрожжеподобных и плесневых грибов), представляет собой обширную и динамично развивающуюся область знаний.Микроорганизмы присутствуют во всех средах, колонизируя как почву и воду, так и живые организмы. Понимание физиологии и генетики микроорганизмов и их взаимодействия с окружающей средой чрезвычайно важно как для профилактики инфекций человека и животных, так и для охраны окружающей среды и развития многих отраслей промышленности. Бактерии составляют самую многочисленную группу среди микроорганизмов по числу видов. Они одноклеточные прокариоты, то есть не имеют клеточного ядра.Вместо клеточного ядра у них есть встроенная в цитоплазму бактериальная хромосома (нуклеоид), построенная из одной кольцевой, запутанной, связанной с белком молекулы ДНК. Наружными оболочками бактериальной клетки являются: белково-липидная клеточная оболочка и клеточная стенка, придающая клетке форму, характерную для того или иного вида бактерий (шаровидную, цилиндрическую или спиралевидную). Некоторые виды бактерий также имеют полисахаридные оболочки для защиты от воздействия внешней среды (например,иммунной системы человека и животных), пилы, позволяющие им прикрепляться к колонизированным поверхностям, и жгутики, обеспечивающие движение бактерий. Определение наличия микроорганизмов и их идентификация в исследуемом материале, взятом от инфицированного человека или животного, или в образце, взятом из окружающей среды, является целью микробиологического исследования. Ход микробиологического исследования можно разделить на следующие этапы: сбор материала и транспортировка его в микробиологическую лабораторию; тестирование материалов с применением различных методов исследования.Сбор материала осуществляется с соблюдением принципов асептики, т. е. способом, исключающим контаминацию образца микроорганизмами из окружающей среды. Собранный материал транспортируют в стерильных контейнерах или в транспортных средах и буферах, соответствующих типу материала и используемым методам исследования. Методы, обычно используемые в микробиологических лабораториях, можно разделить на классические методы и молекулярные методы. К классическим методам относятся: микроскопическое исследование; культивирование и идентификация микроорганизмов на основе биохимических признаков; определение чувствительности культивируемых бактерий к антибиотикам; иммунологические методы.

1

Молекулярные методы используют различные методы для обнаружения характерных последовательностей ДНК или РНК микроорганизма. В настоящее время для обнаружения и идентификации бактерий все чаще используются новые методы, такие как MALDI-TOF-спектрометрия или методы с использованием бактериофагов. Все эти методы будут рассмотрены далее в этом исследовании.

МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ Микроскопическое исследование позволяет определить наличие бактерий в исследуемом материале и наблюдать за морфологией бактериальных клеток.В большинстве случаев этот тест является лишь первым шагом в идентификации микроорганизма, определяющим дальнейшие этапы микробиологического тестирования. В медицине в ряде случаев достаточно подготовки и исследования микроскопического препарата для выявления микроорганизма, вызвавшего инфекцию. Бывает, когда в материале, взятом у больного со специфическими клиническими симптомами, обнаруживаются микроорганизмы характерной, типичной формы. Примерами этого типа инфекции являются инфекции, передающиеся половым путем (сифилис, гонорея) или менингит, вызванный грибком Cryptococcus neoformans.В микробиологической лаборатории для микроскопических исследований обычно используют световой микроскоп с иммерсионным объективом с большими увеличениями (обычно 100х) и высокой разрешающей способностью (апертура 1,4-1,6). Чаще всего используются препараты, окрашенные различными

методами окрашивания.

Препараты

приготовленные

на

предметные стекла

микроскопические непосредственно из материала, взятого у больного, суспендированного в капле физиологического раствора (0,9% раствор NaCl) или в виде мазка взвеси культивируемых бактериальных клеток в капля солевого раствора.Затем предметные стекла высушивают на воздухе и фиксируют, нагревая препарат над пламенем. Наиболее распространенным методом окрашивания является метод Грама, который разделяет бактерии на две группы: грамположительные бактерии, окрашивающиеся в фиолетовый цвет, и грамотрицательные бактерии, окрашивающиеся в розовый цвет. Различия в окраске являются результатом различия в строении клеточной стенки обеих групп бактерий. Грамположительные бактерии имеют клеточную стенку, состоящую из толстого слоя пептидоглюкана (сложного полимера N-ацетилглюкозамина и N-ацетилураминовой кислоты, а также пептидных мостиков и боковых цепей) и частиц липотейхоевой кислоты (LTA), проникающих через пептидогликан.Клеточная стенка грамотрицательных бактерий имеет более сложное строение. Он состоит из тонкого слоя пептидогликана и внешней мембраны, соединенных мостиками из липопротеинов. Петидогликан и наружная мембрана разделены так называемой периплазматическое пространство. Наружная мембрана со структурой типичной белково-липидной мембраны во внешнем липидном слое содержит липополисахарид (ЛПС) с составом, характерным для отдельных видов грамотрицательных бактерий. Проникновение веществ через наружную мембрану возможно благодаря наличию белковых пориновых каналов.

2

Наряду с методом Грама наиболее распространенными методами окрашивания являются также специальные методы с использованием различных красителей, благодаря которым определяются специфические внутренние структуры бактериальной клетки (например, окрашивание на наличие спор) и отрицательное окрашивание, где чернила окрашивают поверхность предметного стекла для визуализации бактериальных оболочек (приготовление чернил). Флуоресцентная микроскопия — это метод, в основном используемый для обнаружения присутствия микроорганизмов непосредственно в материале, взятом у пациента.Приготовление предметных стекол, просматриваемых в люминесцентном микроскопе, заключается в нанесении на фиксированный препарат раствора антител, меченных флуоресцентным красителем, направленным против искомого микроорганизма, а затем тщательном отмывании антител, не связавшихся с микроорганизмами. При освещении препарата УФ-светом флуоресцентный краситель начинает светиться, а клетки характерной для данного вида формы видны только при соединении антител с организмом-мишенью.Влажные препараты используются значительно реже, чем окрашенные препараты, где приготовленный мазок накрывают покровным стеклом.Приготовленный таким образом препарат можно рассматривать под фазово-контрастным микроскопом, позволяющим наблюдать как форму, так и детали строения бактериальной клетки, или в микроскоп с темным полем зрения, где мелкие и спиральные лучше видны микроорганизмы в форме бледной формы (например, бледные спирохеты — бледная трепонема, бактерия, вызывающая сифилис). Просмотр препаратов в электронном микроскопе позволяет визуализировать детали строения микробных клеток: размер, форму, наличие и размеры пупырышек или жгутиков, а также внутриклеточных органелл, а также наблюдать за последующими фазами деления бактериальной клетки. .

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ

И

ИДЕНТИФИКАЦИЯ

МИКРООРГАНИЗМ

НА

ОСНОВА

ОСОБЕННОСТИ

ОСОБЕННОСТИ

БИОХИМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ для выращивания микроорганизмов в желаемых условиях. Бактерии могут расти в самых разных условиях температуры, pH, влажности, осмотического давления и содержания кислорода. Рост бактерий наблюдался в интервале температур от 0°С (психрофилы) до 60°С (термофилы), при этом большинство видов достигали оптимальной температуры роста в диапазоне 20-40°С.Для большинства видов оптимальный рН нейтральный, в пределах 6,5-7,5, а осмотическое давление aw ~ 0,99. В зависимости от потребности в кислороде бактерии можно разделить на: аэробные бактерии, т. е. хорошо растут при наличии кислорода в таком количестве, как в атмосферном воздухе; анаэробные бактерии хорошо растут в присутствии 0,5-1% кислорода; микроаэрофильные бактерии, требующие для роста 5% кислорода и 10% углекислого газа. 3

Многие патогенные бактерии, такие как кишечная палочка или золотистый стафилококк, хорошо растут как в аэробных условиях, так и при пониженном содержании кислорода вплоть до анаэробных.В зависимости от вида микроорганизмов культивирование проводят: в организме восприимчивых к инфекции животных: например, спирохеты Treponema pallidum, размножающиеся в организме кроликов; использование культур клеток животных или человека: например, вирусов, некоторых внутриклеточно размножающихся бактерий, например Chlamydophila pneumoniae; на бактериальные клетки: бактериофаги; на жидких или твердых средах: большинство патогенных бактерий, экологические бактерии. Для роста бактериям требуется наличие источника углерода в виде CO2 для автотрофных видов или органических соединений в среде (сахара, аминокислоты, пептиды, липиды) для гетеротрофных видов, таких как патогенные бактерии.Все виды бактерий также требуют присутствия в среде неорганических солей и часто некоторых витаминов. Бактерии размножаются делением материнской клетки на две дочерние. Время культивирования для получения видимого роста бактерий зависит от скорости их размножения и может составлять от нескольких часов, как в случае большинства видов патогенных бактерий, до нескольких дней, как в случае Mycobacterium tuberculosos. Изменение количества бактериальных клеток в заданном объеме жидкой культуры можно представить в виде кривой, на которой после короткой фазы адаптации клеточного метаболизма к новым условиям (лаг-фазы) происходит логарифмический рост числа бактериальных клеток.С течением времени и истощением питательных веществ наступает стационарная фаза, когда наблюдается равновесие числа отмирающих клеток и новых, образующихся в результате клеточного деления, сменяется фазой отмирания культуры и снижения количество бактериальных клеток. На твердых средах бактерии растут в виде колоний, возникающих в результате деления одной исходной бактериальной клетки. В микробиологической диагностике инфекций, вызванных патогенными бактериями, используют несколько различных групп плотных бактериологических сред.Наиболее широко используются богатые питательные среды, обогащенные кровью, обеспечивающие оптимальные условия для роста подавляющего большинства видов бактерий. Некоторые виды бактерий продуцируют гемолизины, лизирующие эритроциты, что видно в виде яркой зоны вокруг бактериальных колоний. В дополнение к средам, обогащенным кровью, также используются богатые специальные среды, такие как агар Мюллера-Хинтона для оценки чувствительности к лекарственным средствам или шоколадные среды, обогащенные ингредиентами, которые способствуют росту определенных видов бактерий, например.Менингит Neisseria meningitidis. Также используются следующие среды:

4

селективные, содержащие ингредиенты, подавляющие рост определенных групп бактерий, например, агар МакКонки, подавляющий рост грамположительных кокков, или среды, содержащие антибиотики, подавляющие рост чувствительных бактерий к данному препарату; хромогенные среды, содержащие компоненты, которые при метаболизме бактериями придают характерную окраску бактериальным колониям определенных видов, напр.Среда CPS для культивирования бактерий, вызывающих воспаление мочевыводящих путей, позволяющая предварительно идентифицировать виды, вызывающие инфекцию, по цвету. Хромогенные среды с добавлением антибиотиков применяют также для скрининговых тестов с целью выявления у пациентов колоний в респираторном или желудочно-кишечном тракте антибиотикорезистентными бактериями, что является серьезной эпидемиологической проблемой в стационарах. Такие среды используются для обнаружения MRSA (метициллин-резистентных штаммов Staphylococcus aureus, то есть устойчивости ко всем антибиотикам

-

лактамов), выявления VRE (ванкомицин-резистентных штаммов энтерококков) и выявления GramBL-отрицательных штаммов (ES). ферменты, способные гидролизовать многие антибиотики - лактамы) или продуцирующие карбапенемазы (КПК, НДМ-1), расщепляющие карбапенемы.Первичная идентификация бактерий, растущих на плотных средах, основывается на оценке размера, формы и цвета колоний, а на кровяных средах также на наличии гемолиза. Выбор тестов для идентификации производится после оценки морфологии бактериальных клеток в препарате, окрашенном по Граму, и проведения простых тестов, например на способность продуцировать фермент каталазу, разлагающую перекись водорода. Точная идентификация вида осуществляется с использованием ряда твердых или жидких сред в пробирках, позволяющих обнаружить продукцию специфических ферментов (например,уреаза, разлагающая мочевину), или способность расти в присутствии одного сахара (например, среда с лактозой для проверки способности расщеплять лактозу). В настоящее время для идентификации и оценки лекарственной чувствительности микроорганизмов также возможно использование готовых наборов для визуального считывания или считывания в автоматических системах различных производителей (например, Phoenix BD Diagnostic Systems, VITEK 2 Compact BioMerieux). ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ БАКТЕРИЙ К АНТИБИОТИКАМ.эмпирическая терапия, т.е. терапия, подобранная в соответствии с анализом чувствительности к предлагаемому препарату всех видов бактерий, которые могут вызывать данный вид инфекции, и оценкой клинической эффективности лечения предлагаемым антибиотиком. Оценка лекарственной чувствительности бактерий, выращенных из материала, взятого от больного, позволяет ввести так называемую таргетная терапия, соответствующая профилю лекарственной чувствительности выращенного штамма. В лабораториях для определения чувствительности к противомикробным препаратам применяют следующие методы:

5

метод разведения, при котором в жидкую или твердую среду с антибиотиком в определенной концентрации добавляют одинаковое количество бактериальных клеток и оценивают рост в присутствии антибиотика; диффузионный метод, при котором антибиотик диффундирует с диска, пропитанного определенным количеством препарата, или с полоски, пропитанной градиентом антибиотика, в твердый субстрат, равномерно засеянный на поверхность взвесью бактерий с нормированным числом бактериальных клеток ; чтение осуществляется либо путем измерения диаметра зоны ингибирования вокруг диска, либо путем определения концентрации антибиотика, при которой появляется зона ингибирования вокруг полоски.Считываемое значение концентрации антибиотика, подавляющего рост испытуемых микроорганизмов, или диаметры зоны задержки роста вокруг диска сравнивают с пороговыми значениями для чувствительных и резистентных штаммов, а затем интерпретируют « чувствительный» или «резистентный» заносят в результат определения лекарственной чувствительности тестируемого штамма бактерий. В Польше уже много лет используются предельные значения в соответствии с рекомендациями американского CLSI (Институт клинических и лабораторных стандартов). С 2011 года рекомендации Европейского комитета поТестирование чувствительности EUCAST (Европейский комитет по тестированию чувствительности к противомикробным препаратам). Информация о рекомендациях по выбору тестов для определения чувствительности к противомикробным препаратам доступна на сайте Национального центра определения чувствительности к противомикробным препаратам www.korld.edu.pl, а информация об антибиотиках и лечении – на сайте Национальной программы защиты от антибиотиков www. .antybiotyki.pl и сайт национального консультанта в области медицинской микробиологии www.mikrobiologia.пл.

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ Иммунологические методы используют реакцию бактериальных антигенов с антителами против этих антигенов. Реакция происходит между антителами и целыми бактериальными клетками или поверхностными антигенами (капсульные сахара, поверхностные белки) или с токсинами, секретируемыми внеклеточно бактериями. Различные типы меток антител используются, чтобы помочь визуализировать возникновение иммунной реакции. В методе флуоресцентной микроскопии (описанном ранее в разделе «Методы микроскопии») маркером является флуоресцентный краситель.При методе латексной агглютинации на частицы латекса наносятся антитела, а соединение антител с бактериальными антигенами видно в виде комочков. Определение методом латекс-агглютинации чаще всего проводят на предметных стеклах, пластинках из темного стекла или специальных карточках с покрытием, прилагаемых к набору. В методах иммуноферментного анализа, часто называемых ИФА, антитела (если мы ищем бактериальные антигены в материале) или антигены (если мы ищем антитела в жидкостях организма пациента) метят ферментом и комбинацией антигена и антитела видны в виде цветной реакции, которая является результатом фермента, связанного с комплексом антиген-антитело на субстрате 6,

, добавленном в реакционный раствор.Иммуноферментные анализы часто проводят в 96-луночных титрационных микропланшетах, а результат считывают визуально или с помощью спектрофотометрических ридеров. В диагностических лабораториях обычно используют автоматические системы различных производителей (VIDAS BioMerieux, Architect Abbott Laboratories, различные приборы Siemens), в которых определения проводят с помощью разнообразных иммунологических методов. Также постоянно появляются новые автоматические диагностические системы, отличающиеся только методом выявления иммунной реакции.

MATDI-TOF СПЕКТРОМЕТРИЯ В последние несколько лет масс-спектрометрия типа MALD-TOF становится методом, все более и более широко используемым в микробиологической диагностике. Метод основан на анализе белков, присутствующих в большом количестве, таких как рибосомные белки, и позволяет как идентифицировать микроорганизмы (бактерии, дрожжеподобные грибы, мицелиальные грибы), так и анализировать родство внутри изолятов одного вида. В микробиологических лабораториях наиболее часто используется система MALDI BioTyper от Bruker, которая позволяет надежно идентифицировать культивируемые микроорганизмы в течение нескольких минут для одного образца и прибл.1,5 часа для планшета на 96 образцов. Для идентификации достаточно материала, содержащего 105 бактериальных клеток (отдельная колония или образец жидкой культуры). Появились также первые сообщения о возможности выявления микробов непосредственно в образцах мочи, взятых у больного, или в образцах посевов крови. Недостатком метода является его высокая стоимость и невозможность определения чувствительности к антибиотикам культивируемых микроорганизмов. Более подробную информацию об этом методе можно найти на сайте www.bruker.pl

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕТОДЫ В микробиологической диагностике в основном используются методы, позволяющие дублировать гены без их клонирования, т.е. основанные на методе полимеразной цепной реакции, сокращенно ПЦР: Метод ПЦР был разработан в 1980-х годах, но был широко применялся в России во второй половине 90-х годов и заключается в многократном дублировании любой последовательности ДНК с использованием праймеров, т. е. коротких, длиной около 20 нуклеотидов, частиц ДНК, последовательность которых комплементарна конечным последовательностям синтезируемого фрагмента ДНК.Для обеспечения правильного протекания реакции в реакционной смеси помимо матрицы содержится избыток нуклеотидтрифосфатов и избыток реакционных праймеров, т.е. амплифицированная ДНК, выделенная из исследуемого образца (микробная культура, пациент). Реакция ПЦР состоит из следующих многократно повторяющихся (30-40 циклов) стадий: термическая денатурация тестируемой ДНК при температуре около 90°С; прикрепление грунтовок к шаблону при температуре, сниженной до 40-60°С; 7

полимераза, т.е. синтез новых цепей ДНК при 72 С с использованием специальной термостабильной полимеразы.Каждая реакция ПЦР проводится параллельно для тестируемых образцов и положительного и отрицательного контроля. Затем образец реакционной смеси подвергают электрофорезу для визуализации присутствия частиц ДНК определенного размера, соответствующего размеру фрагмента ДНК между праймерами. Разновидность метода ПЦР, т. е. ПЦР в реальном времени, проводимая в специальных приборах и с использованием правильно приготовленных праймеров, также называемых зондами, позволяет считывать результат ПЦР-реакции в ее ходе путем измерения флуоресценции пробы, которая пропорциональна количеству полученного продукта.Оба варианта метода, т.е. как классическая ПЦР, так и ПЦР в реальном времени, в настоящее время используются для определения наличия микроорганизмов (бактерий, вирусов, грибов) в исследуемом образце (кровь, спинномозговая жидкость), а также для выявления генов, кодирующих бактериальные токсины или гены, кодирующие бактериальные токсины, важные механизмы устойчивости к антибиотикам у культивируемых бактерий. На рынке доступны наборы реагентов от разных производителей, позволяющие проводить классические реакции ПЦР или в устройствах ПЦР в реальном времени после выделения ДНК из тестируемого образца.Однако выполнение этих определений требует соответствующего лабораторного оборудования и компетентного, обученного персонала. В последнее время также появились закрытые, простые в использовании и интерпретирующие реакционные наборы для анализа в устройствах ПЦР в реальном времени (например, GeneXpert от Cepheid), позволяющие обнаруживать значимые микроорганизмы в материале, взятом у пациента непосредственно персоналом в период с 1 по 2 ч. Неотложная помощь. Похоже, что ДНК-микрочипы также будут использоваться для обнаружения клинически значимых видов и штаммов бактерий в будущем.Микрочип представляет собой стеклянную или пластиковую пластину с регулярно расположенными фрагментами ДНК, представляющими собой зонды, которые в результате гибридизации обнаруживают комплементарные молекулы ДНК или РНК. Однако в настоящее время микрочипы в основном используются для изучения экспрессии генов. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БАКТЕРИОФАГОВ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ БАКТЕРИЙ Бактериофаги — бактериальные вирусы, состоящие из нуклеиновых кислот (ДНК или, реже, РНК) и белков. Наиболее распространенные бактериофаги характеризуются сложным строением, в котором различают головку, содержащую двухцепочечную ДНК, и хвост, оканчивающийся различными структурами белковых рецепторов, которые позволяют бактериофагу прикрепляться к рецепторам на поверхности бактериальной клетки.Как правило, бактериофаги обладают высокой видоспецифичностью, а некоторые обладают способностью прикрепляться только к определенным штаммам бактерий. Типичный литический жизненный цикл бактериофагов состоит из следующих стадий: 1. прикрепление бактериофага к рецепторам на поверхности бактериальной клетки; 2. введение ДНК внутрь бактериальной клетки, белковый капсид остается снаружи;

8

3. репликация ДНК бактериофага и продукция капсидного белка, образование новых частиц бактериофага; 4.высвобождение потомства бактериофагов после лизиса бактериальной клетки. Некоторые из так называемых бактериофагов Доброкачественные бактериофаги могут переходить в состояние лизогении, которое представляет собой включение ДНК бактериофага в бактериальную хромосому, чаще всего в строго определенном месте, и размножение встроенного профага вместе с бактериальной хромосомой. Под влиянием различных раздражителей профаги могут освобождаться от бактериальной хромосомы и вступать в литический цикл. Доброкачественные бактериофаги в своей ДНК, помимо информации о структуре вирусных белков, могут также содержать гены, кодирующие бактериальные факторы вирулентности, такие как бактериальные токсины (например,холерный токсин — Vibrio cholerae, вызывающий водянистую диарею при холере). Бактериофаги использовались уже в 1950-х годах для селекции различных видов бактерий (например, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa) и в эпидемиологических исследованиях. Для типирования используют метод нанесения раствора, содержащего заданное количество частиц бактериофага, на полужидкую агаризованную среду, содержащую клетки тестируемого штамма бактерий.Лизис бактериальных клеток бактериофагами виден в виде так называемых бляшки, т.е. просветы бактериальной культуры в месте попадания взвеси бактериофага на поверхность агара. Типирование бактериофагов, в связи с высокой трудоемкостью и затратами, связанными с необходимостью поддержания фаговых лизатов и контрольных штаммов, а также низкой воспроизводимостью результатов, связанной с дифференциацией штаммов из-за фенотипа наличия специфических белковых рецепторов на поверхности испытуемого бактериального штамма, в настоящее время заменяется все более совершенными и быстрыми генетическими методами.В последние годы появился ряд публикаций, в которых сообщается о возможности использования бактериофагов для лечения инфекций, а также для обнаружения и идентификации бактерий. С учетом опубликованных результатов проведенных к настоящему времени экспериментов использование бактериофагов в терапии представляется перспективным, но требует дальнейших лабораторных и клинических исследований для оценки безопасности и эффективности такой терапии. Использование бактериофагов в составе биосенсоров, выявляющих наличие микроорганизмов в исследуемом образце, также перспективно и, как представляется, имеет больше шансов на быстрое применение в рутинных лабораторных исследованиях.В этом типе тестов в качестве детекторов присоединения бактериальных клеток, присутствующих в тестируемом образце, к специфичным для данного вида бактериофагам, связанным с сенсорные системы. В публикациях представлена ​​возможность использования данного типа методов для выявления различных видов бактерий, в том числе патогенных, таких как Mycobacterium tuberculosis, Salmonella spp., бациллы сибирской язвы (Bacillus anthracis) или устойчивые к метициллину штаммы золотистого стафилококка (MRSA). 9

Курс бактериологического исследования. Классические методы, применяемые в бактериологической диагностике (идентификация бактерий и определение лекарственной чувствительности

Mgr Kornelia Dobrzaniecka

Определение наличия микроорганизмов и их идентификация в исследуемом материале, взятом от инфицированного человека или животного, или в образце, взятом из окружающей среды, является целью микробиологического исследования.

Микробиологическая диагностика - комплекс предлабораторных и лабораторных процедур, направленных на идентификацию микроорганизмов и определение их лекарственной чувствительности.

Предлабораторные процедуры включают: • определение типа анализируемого материала, • метод сбора клинического материала, • условия хранения и транспортировки.

Сбор материала: • Материал для исследования должен быть взят из места, где протекает болезненный процесс, • Количество материала должно быть достаточным для микробиологического анализа, • Образец должен быть доставлен в лабораторию в кратчайшие сроки по возможности, • материал должен быть хорошо промаркирован и к нему должна быть приложена полная документация, • образец клинического материала должен быть взят до применения лечения, а если это невозможно, информация о препаратах, вводимых пациенту, должна быть предоставил.

Лабораторные процедуры

Микроскопическое исследование прямого препарата, Посев материала на подходящую среду для получения чистых культур, Морфологические и микроскопические наблюдения полученных культур, Исследование физиологических свойств чистых культур, Иммунологические тесты, Определение чувствительности к антимикробным веществам, в том числе лекарственным.

Выделение и идентификация неизвестного микроорганизма: 1. Микроскопическое исследование

• Препарат, изготовленный непосредственно из клинического материала, взятого от больного (ПРЯМОЕ ПРИГОТОВЛЕНИЕ) Пример: мокрота - в случае туберкулеза, вагинальный мазок - оценка степени чистоты спинномозговой жидкости

• Препарат изготовлен из искусственных бактериальных колоний, выращенных на подложках

НЕПОСРЕДСТВЕННОЕ ПРИГОТОВЛЕНИЕ ОБЯЗАТЕЛЬНО НЕПОСРЕДСТВЕННО ИЗ СЛЕДУЮЩИХ КЛИНИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ • кожи и подкожной клетчатки • цервикального, влагалищного и уретрального секрета • спинномозговой жидкости, аспирина, мокроты легких • мазки из глаз • плевральная и перитонеальная жидкости

ПРЯМОЕ ПРИГОТОВЛЕНИЕ НЕ ПРОИЗВОДИМ ИЗ СЛЕДУЮЩИХ КЛИНИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ • Мазок из зева ИСКЛЮЧЕНИЯ: подозрение на дифтерийную ангину Плаута-Венсана, подозрение на грибковую инфекцию • кал новорожденных, подозрение на фекальную инфекцию

Редукционный посев на подходящую твердую среду. Серийное разведение исследуемого материала.

3. Макро- и микроскопическое исследование морфологии полученных культур.

Морфология пластинчатых колоний: Форма (круглая, спиральная, неправильная), Край (правильный, неправильный, зазубренный), Поперечное сечение (выпуклый, плоский, высокий, папиллярный, вросший), Размер, Цвет, Прозрачность, Структура, Консистенция, Запах , Подвеска

Цвет: 1.Простой •

Положительный,

•

Отрицательный,

2. Сложный •

Мет. Грамм,

•

Мет. Циль-Нильсен.

4. Исследование физиологических свойств чистых культур: • •

Культуральные исследования, Биохимические исследования.

Биохимические методы заключаются в определении способности микроорганизмов ассимилировать, ферментировать или разлагать определенные химические соединения.

Масс-спектрометрия MALDI-TOF Инструментом последнего поколения, используемым в клинической микробиологии для идентификации микроорганизмов, является масс-спектрометрия, т.н.MALDITOF MS (матричная лазерная десорбция/ионизация - времяпролетная масс-спектрометрия). Система классифицирует и идентифицирует микроорганизмы путем автоматического анализа их белкового профиля (молекулярный белковый отпечаток) и сравнения со спектрофотометрическими эталонными образцами, хранящимися в базе данных.

Примеры тестов в диагностическом цикле: Тест на каталазу. Каталаза — это фермент, расщепляющий токсичный для клеток h3O2 на h3O и кислород. На предметное стекло наносят каплю 3% раствора h3O2 и подвешивают в ней собранную колонию; пузырьки газа указывают на присутствие каталазы.

Каталазоположительные

Каталазоотрицательные

Micrococcus, Staphylococcus, Corynebacterium, Listeria, Enterobacteriaceae

Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus, Peptostreptococcus, Peptulococcus, Peptulococcus

03. Коагулаза разрезает плазму крови кролика в присутствии активатора коагулазы, который трансформируется в тромбиноподобное соединение. Это соединение, действуя на фибриноген, превращает его в фибрин. Определение проводят методом пробирки.Для теста используется 24-часовая бактериальная культура. Плазму кролика смешивают в культуральной пробирке и инкубируют при 37°С в течение 1-4 часов. Отчетливый сгусток плазмы считается положительным результатом. Если через 4 часа положительный результат не обнаружен, тест следует оставить при комнатной температуре до следующего дня. Определение связанной коагулазы, т.н. «CF-фактор слипания», т.е. сдвиг фибриногена без участия активатора коагулазы. Тест проводят предметным методом путем смешивания взвешенных в капле стерильной воды микроорганизмов с каплей кроличьей плазмы.Результат считывается через 30 секунд. Возникновение агглютинации является положительным.

Коагулазоположительный

Коагулазоотрицательный

S. aureus, S. intermedius, S. hyicus подвиды Hyicus, S. schleiferi подвид Coagulans

S. saprophyticus, S. xylosus, S. gallinarum, S. epidermidis .haemolyticus, S.capitis, S.warneri, S.simulans, S.caprae, S.hominis

5. Иммунологические тесты

• Реакции, при которых происходит прямое связывание антигена с антителом (иммунофлуоресцентные, иммуноферментные и радиоиммунологические реакции), • Реакции с различными физико-химическими реакциями или дополнительными элементами (иммунопреципитация, иммуноэлектрофорез, реакция связывания комплемента)

СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Бескультуральные методы Прямые методы (для обнаружения антигена) Непрямые методы (для обнаружения антител)

Иммунологические реакции : преципитация-агглютинация иммунофлуоресцентный иммуноферментный (ИФА)

ЛАТЕКСНАЯ АГГЛЮТИНАЦИЯ Латексные микрочастицы с покрыты известными антителами, которые связываются со специфическими антигенами.Образуется видимая невооруженным глазом АГГЛЮТИНАЦИЯ.

отсутствие агглютинации отрицательная

агглютинация положительная

Streptococcus Серологические группы по схеме Лансфилда • Ребека Лансфилд в 1933 г. разработал схему серологической классификации β-гемолитических стрептококков. • Анализ основан на выявлении группоспецифических антигенов клеточной стенки. В основном это полисахариды. • Большинство этих антигенов имеют β-гемолитические стрептококки, некоторые α-гемолитические и негемолитические стрептококки.

A - S. pyogenes, несколько штаммов S. anginosus и S. constelatus B - S. agalactiae, C - S. dysgalactiae subsp. equisimilis, S. equi subsp. экви, С. экви подвид. zooepidemicus D - S. bovis (=equinus), Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Streptococcus avium F - некоторые стрептококки группы S.milleri G - в т.ч. пиогенные стрептококки животных (S. canis)

Классификация и номенклатура Salmonella Род Salmonella делится на два вида: 1. Salmonella enterica, внутри которого выделяют шесть подвидов (подвидов):

• • • • •

S.энтерика подвид. enterica (серовары Typhimurium, London, Paratyphi B, Typhi, Enteritidis, Hadar, Mbandaka, Newport) S. enterica subsp. salamae S. enterica subsp. arizonae S. enterica subsp. diarizonae S. enterica subsp. houtenae S. enterica subsp. индика

2.

Salmonella bongori.

•

Серовары других пяти подвидов Salmonella enterica и серовары вида Salmonella bongori описываются антигенными паттернами. Принадлежность сыроделов к этим подвидам обозначается следующими символами: II - S.энтерика подвид. salamae IIIa - S. enterica subsp. arizonae IIIb - S. enterica subsp. diarizonae IV - S. enterica subsp. houtenae VI - S. enterica subsp. Indica V-S. bongori

Источник: http://www.pzh.gov.pl/page/fileadmin/user_upload/SchematWKM2007_01.pdf

Количество известных в настоящее время серологических вариантов (сероваров) у отдельных видов и подвидов Salmonella это: 1. Salmonella enterica

подвид enterica salamae arizonae diarizonae336 houtenae 73 indica

2.Salmonella bongori Всего:

1531 505 99

13 22

2557

В основе деления лежит дифференциация соматического (О-антиген) и цилиарного (Н-антиген) антигенов.

Метод иммуноферментного анализа – ИФА Основан на мечении, т.е. на связывании антигена или антитела с ферментом. Образовавшийся комплекс антиген-антитело-фермент обнаруживается при добавлении бесцветного субстрата, который при расщеплении ферментом дает окрашенный продукт. Цветовую реакцию считывают визуально или на спектрофотометре.Примеры: - Выявление антигенов ВГВ - Определение антител, специфичных к ВИЧ, ВГВ, ВГС, диагностика клещевого энцефалита - Определение титра антител, специфичных к Legionella pneumophila, Borrelia burgdorferii

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕТОДЫ Поиск нуклеиновых кислот в клинической образца или микробной культуры. • метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) • гибридизация нуклеиновых кислот с использованием молекулярных зондов

6. Определение чувствительности к антимикробным веществам, в том числе к лекарственным.

Лекарственная чувствительность

Антибиотики (греч. anti — против, bios — жизнь) — природные органические соединения, вырабатываемые микроорганизмами; также синтетические или полусинтетические, применяемые в качестве препаратов против инфекций, вызванных патогенными микроорганизмами (чаще всего бактериями, но также грибами и простейшими). Химиотерапевтические средства – это соединения, созданные чисто химическим путем, им нет аналогов в природе.

Как это работает • Антибиотики действуют, вызывая гибель бактериальной клетки (бактерицидный эффект) или воздействуя на ее метаболизм таким образом, чтобы ограничить ее потенциал размножения (бактериостатический эффект).

Механизмы устойчивости бактерий к антибиотикам 1. Наружная мембрана грамотрицательных бактерий • мутации поринов 2. Ферментативная инактивация антибиотиков 3. Активная откачка антибиотиков из цитоплазмы - ЭФЛЮКС 4. Модификация мишеней антибиотиков 5. Регуляция резистентности экспрессия генов 6. Перенос генов устойчивости • Мутации существующих генов • Приобретение новых генов (внутри одного вида) - трансдукция (бактериофаги) - трансформация (например, S. pneumoniae - устойчивость к пенциклину) • Межвидовой и межгенеральный перенос генов устойчивости - плазмиды - conjugation transposons

Main groups of antibiotics and chemotherapeutic agents 1 B-lactams

penicillins, penicillins with inhibitors, cephalosporins / cefamycins, monobactams, trigamates, carbapenems, penems

2 Aminoglycosides

streptomycin, neomycin, kanamycin, gentamicin

4 Makrolidy/ketolidy erytromycyna, spiramycyna, josamycyna cykliczny węglan erytromycyny (Dawercin), roksytromycyna, klarytromycyna, azytromycyna, dirytromycyna, trolitromycyna 5 Linkozamidy

linkomycyna, klindamycyna

6 Streptograminy

pristinamycyna, chinupristina, dalfopristina

7 Oksazolidynony

linezolid

8 Glikopeptydy

wankomycyna, teikoplanina

9 Chloramfenikol

detreomycyna

10 Polimiksyny

kolistyna

11 Rifamycyny

rifampicyna

12 Sulfonamidy

kotrimoksazol

13 Nitroimidazole

metronidazol, орнидазол

14 Нитрофураны

нитрофурантоин, фурагин, нифуроксазид

15 Хинолоны

пипемидовая кислота, норфлоксацин, пефлоксацин, ципрофлоксацин, офлоксацин, левоксифлоксацин, мароксифлоксацин, мароксифлоксацин oxacin

16 Fusidic acid 17 Polyene antifungal agents: nystatin, amphotericin B azole: fluconitride, itraconazole, ketoconazole, econazole, voriconazole antimetabolites: 5-fluorocytosine, indiviral drugs, gudiclovir

aciclovir, famanciclovir

ritonavir, saquinavir, stavudine, zalcitabine, zidovudine

Спектр действия

СПЕКТР ДЕЙСТВИЯ

УЗКИЙ СЕКТР - ОГРАНИЧЕННЫЙ E.G.ДЛЯ ЗЕРНА

ШИРОКИЙ СПЕКТР - ГРАММ (+) И ГРАММ (-) (+/- АНАЭРИДЫ)

БЕНЗИН ПЕНИЦИЛЛИН ВАНКОМИЦИН

ПОЛУСИНТЕТИЧЕСКИЕ ПЕНИЦИЛЛИНЫ

ПОЛУСИНТЕТИЧЕСКИЕ ПЕНИЦИЛЫ микроорганизма 9000EM.

Лекарственная чувствительность: 1. Полуколичественный метод - АТБ, 2. Диффузионно-дисковый метод - тканевые диски, пропитанные антибиотиком, 3. Количественный метод - Е-тесты,

4.Автоматические системы

Е-тест - метод, применяемый для определения минимальной концентрации антибиотика (МПК), подавляющей рост микроорганизма. Используют полоски, пропитанные антибиотиком в градиенте концентрации. АТБ-полоска позволяет определить чувствительность тестируемых бактерий к антибиотикам в полужидкой среде. Диско-диффузионный метод - наиболее часто используемый метод, основанный на диффузии антибиотика, содержащегося в диске, в субстрат. Антибиотик диффундирует радиально, создавая градиент концентрации.

Сигнальные штаммы Во время пребывания в больнице у пациента может развиться инфекция, которая является прямым результатом госпитализации.Оно может проявляться после выписки из больницы и может касаться медицинского персонала или посетителей. Этиологическими факторами внутрибольничных инфекций могут быть как бактерии и вирусы, так и грибы и паразиты.

Перечень факторов тревоги, составляющий Приложение № 1 к Постановлению Министра здравоохранения 23 декабря 2011 г. о перечне тревожных факторов, регистрах госпитальных инфекций и тревожных факторов и отчетах о текущей эпидемиологической ситуации в стационаре (ЖурналЗаконов 2011 г., № 294, ст. 1741) 1. Staphylococcus aureus, устойчивый к метициллину (MRSA) или гликопептидам (VISA или VRSA) или оксазолидинонам. 2. Энтерококки (Enterococcus spp.), устойчивые к гликопептидам (VRE) или оксазолидинонам. 3. Грамотрицательные виды Enterobacteriaceae, продуцирующие бета-лактамазы с расширенным субстратным спектром (например, ESBL, AMPc, KPC) или устойчивые к карбапенемам или другим двум классам лекарств или полимиксинам. 4. Голубая масляная палочка (Pseudomonas aeruginosa), устойчивая к карбапенемам или другим двум группам препаратов или полимиксинам.5. Неферментирующие палочки рода Acinetobacter spp., устойчивые к карбапенемам или другим двум группам препаратов или полимиксинам. 6. Патогенные штаммы Clostridium difficile анаэробные и продуцируемые ими токсины А и В.

7. Clostridium perfringens анаэробные. 8. Расщепленная пневмония (Streptococcus pneumoniae), резистентная к цефалоспоринам третьего поколения или пенициллину. 9. Грибы Candida, устойчивые к флуконазолу или другим азольным или кандиновым препаратам. 10. Грибы аспергиллы.

11. Ротавирус (ротавирус). 12. Норовирус (норовирус). 13. Синцитиальный вирус (РСВ) 14. Вирус гепатита В 15. Вирус гепатита С 16. Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ). 17. Биологические патогены, выделенные из крови или спинномозговой жидкости, ответственные за генерализованные или инвазивные инфекции.

Методы обнаружения и идентификации бактерий Dorota abicka Zakad

Методы выявления и идентификации бактерий Dorota Żabicka Кафедра эпидемиологии и клинической микробиологии Национальный медицинский институт Варшава

Структура бактериальной клетки

Микробиологическое исследование l Цель: выявление этиологического фактора инфекции и определение чувствительности к антибиотикам l Курс микробиологического исследования l l Сбор проб Исследование материала: l l Классические методы l Микроскопическое исследование l Посев и идентификация микроорганизма l Определение чувствительности бактерий к антибиотикам l Иммунологические методы Молекулярные методы

Сбор и перенос материала Тип транспортной среды и тип контейнеров подбираются в соответствии с типом материала и направлением исследования (бактерии, вирусы, наличие антител)

Микроскопическое исследование Световой микроскоп l Окрашенные образцы l Метод Грама l Специальные методы, напр.окрашивание спор l Clostridium tetani tetanus, споры на конце бактериальной клетки, придающие форму барабанщика

Бактериальная клеточная стенка Грамположительные бактерии Грамотрицательные бактерии

Микроскопическое исследование Neisseria meningitidis Препарат осадка спинномозговой жидкости, окрашенный по Граму Cryptococcus neoformans Препарат осадка спинномозговой жидкости

Микроскопическое исследование Препарат с темным полем зрения (Treponema pallidum) l Флуоресцентный микроскоп l

Микроскопическое исследование Фазоконтрастный микроскоп для выявления грибов рода Candida

Микроскопическое исследование Электронный микроскоп

Бактериальная культура l Применяемые жидкие и твердые бактериологические среды l Культивирование в условиях, наиболее подходящих для целевых микроорганизмов l Время культивирования от нескольких часов (напр.колиформные бактерии, т. е. Escherichia coli) до нескольких дней (например, микобактерии туберкулеза, т. е. Mycobacterium tuberculosis)

Требования для роста бактерий l Потребность в кислороде l l Источник углерода l l l Аэробный – O 2 Анаэробный – менее 1–0,5 % O 2 Микроаэрофильный – смесь 5 % O 2, 10 % CO 2, 85 % N 2 Автотрофный – CO 2 Гетеротрофный – амино кислоты, пептиды, сахара, липиды Другие соединения, необходимые для роста l l Неорганические соли Витамины

Физические и химические факторы l Температура l l с.H l l Психрофилы - оптимум 0-10 С Мезофилы - оптимум 20-40 С Термофилы - оптимум 50-60 С Большинство бактерий предпочитают нейтральные значения р. Н ~ 7,0 Осмотическое давление l Большинство предпочитают aw ~ 0,99

Рост культуры бактерий в жидкой среде

Культура и идентификация микроорганизмов Агаризованная среда, обогащенная кровью - видимая зона гемолиза вокруг колонии

Культура и первичная идентификация микроорганизмов ХПС Селективные, хромогенные селективно-дифференцирующие и специальные среды Мак.Конки-агар

Определение механизмов устойчивости к антибиотикам – хромогенные субстраты MRSA ESBL VRE

Культивирование и идентификация микроорганизмов Идентификация микроорганизмов с помощью анализов на чашках Тест на чувствительность к бацитрацину CAMP

Культуры и идентификация микроорганизмов Идентификация микроорганизмов с использованием наборов для пробирок готовых идентификационных тестов

Автоматические системы используются для культивирования микроорганизмов (например,Bactec для посева крови) или для идентификации и определения антимикробной чувствительности ранее выращенных твердых микроорганизмов VITEK 2 Compact Bio. Диагностические системы Merieux Phoenix BD

VITEK 2 Compact System Автоматическая система для идентификации и определения антимикробной чувствительности микроорганизмов, ранее выращенных на твердых средах

Определение чувствительности к противомикробным препаратам l Определение методом разведения l Готовые диагностические тесты для ручного считывания l Определение с помощью автоматизированных систем

Определение лекарственной чувствительности и механизмов устойчивости к антибиотикам Диффузия с диска Антибиотическая среда Диффузия с полоски Штамм Staphylococcus aureus, устойчивый ко всем лактамным антибиотикам (MRSA)

Иммунологические методы Латекс, ИФА, иммунофлюоресцентные тесты, выявляющие целые клетки или бактериальные антигены (поверхностные белки, капсулярные сахара, токсины) l Они позволяют обнаружить бактерии в материале, взятом от больного, или помогают в идентификации культивируемых бактерий l Использовать готовые проведены ручные или автоматические тесты l Латексная агглютинация

Иммунологические методы – ОВОС

Иммунологические методы - автоматические системы Система VIDAS

Новые методы, основанные на иммунологических методах

Спектрометрия MALDI-TOF

MALDI-TOF-спектрометрия

Спектрометрия MALDI-TOF

Молекулярные методы В основном используемые методы, основанные на реакциях ПЦР или ПЦР в реальном времени l Различные готовые коммерческие тесты, доступные в двух вариантах l Набор реагентов для обнаружения бактерий, реакции в любом аппарате для ПЦР или ПЦР в реальном времени l Наборы реагентов или закрытые диагностические системы, предназначенные для использования в аппаратах конкретной фирмы. l Тесты как на обнаружение бактерий, т.е.M.tuberculosis, а также идентификация эпидемиологически важных бактерий, например, MRSA или обнаружение бактериальных токсинов l

Бактериальный геном Бактериальная хромосома разного размера в зависимости от вида бактерий и наличия встроенных подвижных элементов (плазмид, транспозонов, бактериофагов)

Метод ПЦР

DNA Ruler 100 6018/99 6758/99 ATCC 43300 ATCC 29213 Ruler 100 PCR method mec A около 550 kb mec Ген, присутствующий в MRSA

ПЦР в реальном времени Кривые реакции ПЦР в реальном времени

Быстрые молекулярные тестыГен. Эксперт

Зонды Scorpion Два типа зондов Scorpion, используемые в анализах серии Gene. Экспертные рисунки: источник Cepheid

Интегрированный внутренний контроль в реакционной смеси Mg 2+ мишень скорпион Taq ДНК-полимераза IC скорпион d.CTP d.GTP d.Внутренний контроль UTP (IC) d.Чертежи ATP источник Cepheid

Микрочипы

Бактериофаги - бактериальный вирус

Бактериофаги – морфология

Бактериофаги - жизненные циклы 9000 4 90 128

Бактериофаги – применение в диагностике l Типирование бактерий для определения родства выделенных штаммов бляшек

Бактериофаги – применение для обнаружения и идентификации бактерий

Бактериофаги – применение для обнаружения и идентификации бактерий

Бактериофаги – применение для обнаружения и идентификации бактерий

Спасибо за внимание

Смотрите также

• 
  Hgb гемоглобин
• 
  Прививка от бешенства при укусе собаки
• 
  Вирусный бронхит симптомы и лечение у взрослых
• 
  Снять симптомы простуды
• 
  Панические атаки клинические рекомендации
• 
  Как укрепить желудок при расстройстве
• 
  Очистить кровь в организме чем можно
• 
  Когда сдавать пцр на коронавирус после контакта
• 
  Снять кольцо с опухшего пальца в домашних условиях
• 
  Лечение нарушения мозгового кровообращения у пожилых людей
• 
  Язва 12 перстной кишки лечение